新疆冷水鱼肠道肠球菌、乳杆菌的分离筛选及生理学特性的研究

时间：2015-12-21 01:00:35 所属分类：水产与渔业 浏览量:

水产养殖论文发表 第一章 文献综述 1.1 乳酸菌概述 乳酸菌是一种主要产物为发酵糖类的、无芽孢、革兰氏染色呈阳性的细菌。凡是能从葡萄糖以及乳糖的发酵过程中，产生乳酸的细菌细菌都被称为乳酸菌。根据《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’s Manual of System

水产养殖论文发表　　

　　第一章 文献综述

　　1.1 乳酸菌概述

　　乳酸菌是一种主要产物为发酵糖类的、无芽孢、革兰氏染色呈阳性的细菌。凡是能从葡萄糖以及乳糖的发酵过程中，产生乳酸的细菌细菌都被称为乳酸菌。根据《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)第 8 版中描述，目前在自然界中已发现的乳酸菌至少有 23 个属，大约共有 200 多种，其中每个属又包括多个种，多数乳酸菌还包括数个亚种[1-3]，其中绝大部分都具有重要生理功能，是人体内必不可少的菌群。乳酸菌广泛存在于人类、家禽、牲畜和鱼内脏中。许多物料、食品及少数临床样品中也存在有乳酸菌。乳酸菌能改善食品风味，提高食物的营养价值，提高食品贮藏性能和增加食品的附加值。因此，近年来有关乳酸菌特殊生理活性和营养功能方面的研究，越来越受到人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节胃肠道正常菌群，使肠道保持微生态平衡，降低血清胆固醇，控制内毒素，提高食物生物价和消化率，抑制肠道内腐败菌生长繁殖，抑制腐败产物的产生，制造部分营养物质，刺激机体个别组织发育，从而对机体的生理功能、营养状态、药物效应、细胞感染、毒性反应、肿瘤发生、衰老过程、突然的应急反应和免疫反应等产生作用。由此可见，乳酸菌存在与机体的活动息息相关。可以说，倘若乳酸菌停止生长或死亡，人和动物就很难健康生存。因此，乳酸菌被广泛用于轻工业、饲料工业、食品及医药等许多行业[4]。

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　　1.2 乳酸菌的分类

　　乳酸菌广泛分布于自然界中，在农牧业、工业、轻工业、食品和医药等与人类生活密切相关的领域都具有着很高的应用价值。此外，乳酸菌中还存在一些是人畜的致病菌的菌属，这些致病菌属也受到了人们极大的重视。通常情况下，按传统思维去理解，这类细菌的范围比较狭窄，其中包括的属种也比较少。但是如果按照乳酸菌名称的定义及由来、通过全方位了解细菌分类学、研究近年来已报道的细菌属种以及其主要形态等特征，经过分析、比较，整理出符合乳酸菌定义的细菌，然后列出乳酸细菌的有关属，并划分出乳酸细菌的范围。因此可以说明，乳酸细菌是一种数量庞大，分类相对复杂的细菌，它涉及的属种范围很广，并且还在不断的增大[5]。对于菌属的分类，我们通常根据伯杰氏系统细菌学手册，该手册自 1923 年至今已出版了 9 版，是国际上普遍采用的菌属分类的方法。在手册第 7 版中产乳酸的细菌被列入真细菌目(Eubacteriales)下的棒杆菌科(Corynebacterizceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)和乳杆菌科(Lactobacillaceae)的有关属内[6]。在手册 8 版列入不同部分的芽孢杆菌科、链球菌科(Streptococcaceae)、乳杆菌科以及放线菌目(Actinomycetales)下放线菌科(Actinomycetaceae)的相关属。在手册新版中，不同部分的乳酸细菌的有关属相比较第 8版又增加了环丝菌属(Brochothrix)，在链球菌属(Streptococus)中对其不同类型的菌也分别进行了描述，属的内容也丰富起来了，还增加了许多新种[7]。近 10 年来，在革兰氏阳性球菌建立了 8 个新属，乳球菌属(Lactococcus)、糖球菌属(Saccharococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、乳球形菌属(Lactosphaera)、漫游球菌数(Vagococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)和营养缺陷菌属(Abiotrophia)。在革兰氏阳性杆菌和不规则形杆菌中又建立了三个新属：魏斯氏菌属(Weissella)、奇异菌属(Atopobium)、和肉食杆菌属(Carnobacterium)[8]。

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　　第二章 耐低温肠球菌、乳杆菌的分离、纯化及形态学初步鉴定

　　2.1 引言

　　乳酸菌在环境中广泛的存在，利用传统的方法从鱼的肠道及肠道粘膜中分离在低温环境中生长的低温乳酸菌是很有意义的，能够进一步加深我们对低温乳酸菌资源的认识和开发，将其应用于更广阔的领域，有着更为广泛的应用前景。

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　　2.2 实验材料

　　2.2.1 冷水鱼的采集

　　取冷水鱼样品共 18 种，分别为草鱼(grass carp)，黑斑狗鱼(Esox reicherti)，白斑狗鱼(Esox lucius)，丁鲑(Tinca tinca)，东方欧鳊(Abramis brama Orientalis)，梭鲈(Luciopercalucioperca)，鲫鱼(Carassius auratus gibelio)，细鳞鱼(Qinling lenok)，雅罗鱼(Leuciscus)，唇鱼(Semilabeo notabilis)，兔子鱼(Macropodus opercuiaris)，哲罗鲑(Hucho taimen)，大马哈鱼(Oncorhynchus keta)，鳜鱼(siniperca chuatsi)，白鱼(Blanquillo)，河鲈(percafluviatilis)，红尾鱼(Rasbora borapetensis)，鲶鱼(silurus asotus)。样品于 2013 年 5 月采自新疆阿勒泰地区，贴上标签，置于车载冰箱内-1-4℃冷藏，并于 12 h 内运回实验室。将运回实验室的样品立即在超净工作台上解剖，取其肠道内容物及肠道粘膜分别置于已经灭好菌的 EP 管内，4℃冰箱内保藏备用。解剖用的手术刀以及放置肠道所需的培养皿需要提前灭菌后使用。

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　　2.3 实验方法

　　2.3.1 耐低温菌株的分离

　　从 EP 管内取出 0.2 g 的肠道内容物及肠道粘膜，于 1.8 mL 灭菌的生理盐水中，在摇床上震荡 30 min。然后用生理盐水梯度稀释，取合适梯度的悬浮液分别涂布于 MRS、Elliker、M17 琼脂、改良番茄、双歧杆菌、肠球菌琼脂以及乳杆菌选择性琼脂，7 种固体培养基上，并将其置于 16℃恒温培养箱中，培养 5-7 天，待菌落形成后继续划线分离。所有的操作都需在超净工作台上进行，均是为了保证分离菌株的原位性。

　　2.3.2 耐低温菌株的纯化

　　将已经分离的耐低温菌株反复在 MRS 固体上划线在中，直到在固体培养基中出现纯的、单一的并且无其它杂菌的纯培养菌落。

　　………

　　第三章 耐低温菌株的 16S rRNA 序列分析........21

　　3.1 引言..........21

　　3.2.实验材料

　　....... 21

　　3.3 实验方法....... 21

　　3.4 结果与分析......... 23

　　3.5 本章小结....... 30

　　第四章 耐低温肠球菌、乳杆菌菌株的耐盐性.........31

　　4.1 引言..........31

　　4.2 实验材料.........31

　　4.3 实验方法....... 31

　　4.4 结果与分析......... 33

　　4.5 本章小结....... 38

　　第五章 耐低温肠球菌、乳杆菌菌株药敏性的研究.......40

　　5.1 引言..........40

　　5.2 实验材料...... 40

　　5.3 实验方法...... 40

　　5.4 结果与分析......... 41

　　5.5 本章小结....... 43

　　第五章 耐低温肠球菌、乳杆菌菌株药敏性的研究

　　5.1 引言

　　肠道中分离得到的菌株可以在食品工业以及调节肠道菌群平衡中得到一定的应用，如果将携带可转移耐药因子的菌株应用方在生产中，将会严重威胁到食品的安全性。因此对菌株的药敏性进行一定的研究和确定是很有必要的。在测试菌的平板上贴上含有抗菌药物的纸片，这些纸片含有一定量的抗菌药物。在纸片上的可抑制菌株生长的浓度范围之内测定该菌的生长状况，形成了无菌生长的透明圈抑菌圈。抑菌圈直径的大小，可以反映测试菌株对所测定药物的敏感程度。从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落接种至培养液中 20℃培养 36h，用于药敏试验的菌液浓度约为(1.5～3.0)×108个/ mL[73-76]。用灭菌的棉签蘸取菌液，均匀地涂于整个平板表面，放置约 10 min，使琼脂表面干燥。待表面干燥后，用小镊子取出所需的不同药敏纸片，均匀地贴在培养基的表面，将纸片压平，注意纸片间应有一定的距离，作上标记。将培养皿放在 16℃的温箱内培养 24 h，然后用游标卡尺或直尺量测量各种药敏纸片抑菌圈直径的大小，单位为 mm。

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　　结论

　　本实验用利用 MRS、Elliker，肠球菌琼脂培养基(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)，M17 琼脂培养基，乳杆菌选择性琼脂培养基，双歧杆菌 BS 培养基，改良番茄汁培养基，7 种不同培养基从新疆阿勒泰地区采样获得的 18 种冷水鱼肠道及其肠道粘膜中，分离筛选出耐低温菌，并通过菌落的大小、形态以及接触酶和革兰氏染色实验对分离的耐低温菌进行初步的鉴定，根据 16S rRNA 基因序列初步确定耐低温菌的系统进化地位，然后测定细菌最适生长温度并进行常规生理生化实验。最后通过纸片法对分离菌株的药敏性进行了初步研究。得出以下结论：

　　1、本研究利用 MRS、Elliker，双歧杆菌 BS 培养基，肠球菌琼脂培养基(胆汁七叶苷叠氮钠琼脂)，M17 琼脂培养基，乳杆菌选择性琼脂培养基，改良番茄汁培养基，共 7种不同培养基从新疆阿勒泰地区 18 种冷水鱼肠道内容物及其粘膜中，分离筛选出耐低温菌 161 株。通过形态学观察：耐低温菌株中有 63 株菌的菌落颜色呈白色；有 50 株菌的菌落颜色呈乳白色；19 株菌的菌落颜色呈淡黄色；21 株菌的菌落颜色呈灰白色；半透明状的有 3 株；透明状的 2 株；浅橘色和浅褐色的各为 1 株和 2 株。肠球菌的培养基比较特殊，菌株的产物与培养基里面的柠檬酸铁胺反应，会产生黑色的菌圈。耐低温菌株中有 16 株菌的菌落形态较大；有 44 株菌的菌落直径中等；其余的 101 株很小。另外，大多数的耐低温菌株为乳白色，部分菌株也呈现出淡黄色，还有一部分菌株为白色透明。最后通过革兰氏染色和接触酶实验初步确定 161 株分离菌为疑似乳酸菌。

　　2、通过 16SrDNA 序列同源性分析显示 161 株菌株分别隶属于 Antarctic bacterium、Bacillus、Burkholderia、Carnobacterium、Enterococcus，Hafnia、Leuconostoc、Lactobacillus、Pseudomonas 和 Vagococcus 十个属。其中有 12 株菌属于 Antarctic bacterium；1 株菌属于 Bacillus，这株菌是 BS-CGM-2；1 株属于 Enterococcus，这株菌是 M17-JYC-3；12株属于 Burkholderia；49 株属于 Carnobacterium；2 株属于 Hafnia，分别是 M17-HLM-4，M17-DMHM-3；67 株属于 Lactobacillus，7 株属于 Leuconostoc；1 株属于 Vagococcus；其余的均属于 Pseudomonas 属。其中 Lactobacillus 占有的比例最大，占其中的 41%。

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　　参考文献(略)

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