时间：2015-12-21 01:04:05 所属分类：水产与渔业 浏览量:
海洋，是一个充满宝藏的地方，海洋里面所蕴藏的资源也是非常丰富的，这些资源如果可以得到合理的开发和利用，那么对于农业的发展也是很有帮助的。 1 材料和方法 1.1.1 菌种 样品采集于威海近海海域，利用CMC平板划线法进行分离纯化获得;进行固定化酶的菌株来
海洋，是一个充满宝藏的地方，海洋里面所蕴藏的资源也是非常丰富的，这些资源如果可以得到合理的开发和利用，那么对于农业的发展也是很有帮助的。
1 材料和方法 1.1.1 菌种 样品采集于威海近海海域，利用CMC平板划线法进行分离纯化获得;进行固定化酶的菌株来源于实验室已有的海洋细菌资源库。 1.1.2 培养基 2216E海洋细菌培养基;初筛培养基：含羧甲基纤维素钠(CMC-Na);发酵培养基：其基本成分和初筛培养基大致相同，区别是不含琼脂;LB培养基：蛋白胨5.00 g，NaCl 0.10 g;酵母粉1.00 g，柠檬酸铁0.01 g，KCl 0.70 g，MgS04·7H20 6.30 g，MgCl2·6H20 4.20 g ,CaCl2·2H2O 1.30 g，NaHCO3 0.20 g，蒸馏水1 000 mL，pH为7.6～8.0。 1.2 试剂和仪器 0.5%羧甲基纤维素钠、DNS试剂、戊二醛、壳聚糖;紫外分光光度计(上海第三分析仪厂)，摇床(上海福玛实验设备有限公司)。 1.3 纤维素酶产生茵的筛选方法 采用刚果红染色鉴定法：在培养基上涂抹刚果红染液以后，一段时间后，选择红色退去的区域的细菌作为初筛菌种，通过划线分离法，得到单菌落。。 1.4 发酵产酶试验 将划线分离得到的单菌落由斜面接到100 mL(250 mL三角瓶)液体发酵培养基中，于28℃、180 r/min培养24 h，制成种子液。然后按5.0%的接种量将种子液加到100 mL(250 mL三角瓶)相应液体培养基中，于28℃、180 r/min条件下进行产酶试验，定时取样，4 000 r/min离心10 min后测定发酵液中的酶活力。 1.5 纤维素酶的固定化 取适量的的壳聚糖加入一定浓度的戊二醛溶液中，室温下搅拌2 h，4℃过夜;离心去上清，水洗2～3次洗去残余的戊二醛;在交联后的壳聚糖中加入纤维素酶液适量，室温下搅拌1.5 h，于4℃冰箱中静置过夜;然后将游离酶洗掉，剩下的即为固定化酶。 1.6 纤维素酶活力的测定 ①葡萄糖标准曲线的绘制：配制7个浓度系列的标准溶液，采用3，5一二硝基水杨酸比色定糖法，测定反应液中葡萄糖含量。以葡萄糖含量为横坐标，以对应的光密度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。 ②取l mL羧甲基纤维素钠于试管中，加入稀释的游离酶l mL或一定量的固定化酶(0.10～0.50 g)，50℃水浴反应30 min，加3 mLDNS混匀，沸水浴10 min，取出冷却到室温后加蒸馏水至25 mL，混合均匀后在540 nm处测吸光光度值(D540 nm)。 1.7 固定化的纤维素酶的性质测定 在不同的戊二醛浓度条件下，测定对酶活性的影响。
2 结果与分析 2.1 菌株鉴定 经过克隆测序分析，该菌为Microbulbifer。 2.2 培养时间对细菌的生长及其产酶的影响 检测实验菌株在28℃的生长及产酶情况：实验观察到该菌株的生长周期比较长，主要是稳定期的时间较长;而在对数生长期到稳定期的前期，细菌产生比较多的纤维素酶;到达稳定期以后，纤维素酶基本的产量基本保持稳定。 2.3 戊二醛浓度对固定化酶的酶活性的影响 分别称取6份0.50 g的壳聚糖，加入到4 mL的浓度分别为1.0%～6.0%的戊二醛中，参照之前的步骤得到固定化酶，检测其酶的活性。由结果可知随戊二醛浓度增大固定化酶的酶活力先增大减小，当戊二醛浓度高于3.0%时，酶活力显著下降。所以在上述的试验条件下，3.0%戊二醛浓度可以让壳聚糖分子上的氨基全部发生交联，此时，固定化酶的活力达到最高。另一方面因为戊二醛能够使蛋白质变性，浓度太大会使酶变性而使得活力下降。
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