时间：2015-12-21 01:05:00 所属分类：水产与渔业 浏览量:
Wilkins等［1］首次定义了蛋白质组（proteome），他将其定义为：一种基因组所表达的全套蛋白质。这一概念的出现标志着蛋白质组学的诞生。现在对蛋白质组确切定义为：一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。蛋白质组学是后基因组时代的一门
Wilkins等［1］首次定义了蛋白质组（proteome），他将其定义为：一种基因组所表达的全套蛋白质。这一概念的出现标志着蛋白质组学的诞生。现在对蛋白质组确切定义为：一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质。蛋白质组学是后基因组时代的一门新兴学科，是指基因组在某个细胞或组织中表达的全部蛋白质及其存在方式，旨在从蛋白水平上揭示生理的本质和生命活动规律［2］。
蛋白质组学的核心技术为二维凝胶电泳技术、计算机图象分析与大规模数据处理技术和质谱技术。它的前沿大致分为3个方向：第一，针对基因组数据库的生物体或组织/细胞，建立其蛋白质组。第二，以重要的生命过程或人类重大疾病为对象，进行重要生理过程的比较蛋白质组学研究。第三，蛋白质组学技术支撑技术平台和生物信息学研究［3］。随着蛋白质组学的发展，差异蛋白质组学越来越引起广大学者的关注，主要是由于生物体内蛋白质种类、数目在发育过程中以及在不同的环境条件下具有时空性和可调节性等，所以可以通过筛选由某因素引起的差异蛋白质谱，从分子水平上揭示生命现象的本质［4］。差异蛋白质组学技术在水产动物研究中的应用，不仅对更好地利用这些水生资源有重要意义，还可以为预防、诊断、治疗水产动物疾病提供参考，也可以为养殖水环境调控以及污染监测提供科学依据。
1差异蛋白质组学技术
目前差异蛋白质组学研究多采用传统的蛋白组学技术，如双向电泳、质谱等，但无论是双向电泳还是质谱技术都存在着缺陷。双向电泳不能捕获细胞内的全部蛋白质，因为分子量过大或过小的蛋白难以用其分离，极酸或极碱的蛋白在电泳过程中容易发生丢失，而且低拷贝蛋白和难溶蛋白也难以检测到［5］。质谱在分析蛋白质之前需要对样品进行必要的纯化，且无法实现高通量蛋白质分析，无法区分分子和带电荷相同的同分异构体的质量［6］。这些技术的缺点阻止了差异蛋白质组学研究在当前大规模地迅速开展，但近几年一些新技术的发展为差异蛋白组学的发展提供了条件。如荧光双向差异凝胶电泳和稳定同位素特征标签生物质谱、激光捕获微切割技术、表面增强激光解吸电离-飞行时间-质谱技术等［7-10］。
2差异蛋白质组学技术在水产动物研究中的应用
2.1在水产动物环境毒理方面的应用
无论是在淡水环境还是海水环境，日益严重的环境污染对鱼类、贝类、甲壳类及棘皮动物等水产动物造成了严重的危害，同时也严重影响了水产食品的安全，威胁着人类的健康。为了寻找污染物风险评价的生物标志物及为环境污染监测提供科学依据，众多学者采用差异蛋白质组学技术来研究水产动物并取得了一定的成果。有机物的污染是其中的一个方面，包括苯类物质、有机磷类物质等。苯类物质主要有多氯联苯、酚类物质等，贻贝（Mytilusedulis）鳃组织在多氯联苯等胁迫下被检测出诱导的差异蛋白表达信号，为肌浆球蛋白、肌动蛋白等，并且发现贻贝组织的蛋白表达信号具有污染物特异性［11-13］；DeWit等［14］采用差异蛋白质组技术分析两个斑马鱼成鱼群体肝脏内四溴双酚A（TBBPA）的分子靶标，推测了TBBPA的毒理机制。将稀有鮈鲫（Gobiocyprisrarus）暴露在1、10和100μg/L的2,4,6-三氯酚（2,4,6-TCP）中，研究其肝脏损伤的蛋白表达谱，结果发现35个差异蛋白点，其中11个蛋白被成功鉴定，它们主要参与脂类代谢与转运、氧化应激以及蛋白修复和氧化磷酸化等生物学过程［15］。对大西洋鳕鱼（Gadusmorhua）和虹鳟（Scophtalmusmaximus）在苯酚和双酚A胁迫下血清蛋白表达图谱的分析表明，鳕鱼差异蛋白表达更敏感［16］。有机磷的污染物主要为甲基对硫磷，那宏坤等［17］从甲基对硫磷胁迫下牙鲆（Paralichthysolivaceus）鱼脑组织，鉴定出17种差异表达蛋白质，主要为热休克蛋白、细胞色素P450和谷胱甘肽S-转移酶。还有一些其他的难降解的污染物，如全氟辛烷磺酸盐（PFOS）。Shi等［18］从暴露于0.5mg/LPFOS胁迫发育192h的斑马鱼胚胎中，鉴定了69个差异表达量超过2倍的蛋白，通过质谱技术鉴定了18个蛋白。这些蛋白参与了细胞多种生命过程，包括能量代谢、脂质代谢、信号转导及细胞凋亡等。从蜘蛛蟹（Hyasaraneus）、滨蟹（Carcinusmaenas）和贻贝暴露在不同污染物中蛋白表达图谱的变化，发现滨蟹比蜘蛛蟹差异蛋白的表达更显著，而且贻贝差异蛋白的变化与污染物种类具有较好的相关性［19,20］。
重金属污染物主要为镉、铜、铅、汞和锌等离子。Shepard等［21］发现贻贝在不同浓度铜离子中，其总蛋白差异表达，而且溶酶体的破坏程度与铜离子浓度呈正相关，虹鳟鳃在锌离子浓度小于3.5mol/L时，蛋白表达图谱中有22种蛋白表达发生差异［22］。多种水产动物在重金属镉作用下发生蛋白的变化，如贻贝消化腺、鳃和外套膜具有差异蛋白［23］；扇贝腮筛选出37个由于镉盐胁迫而产生的差异蛋白质斑点，其中7个是与镉毒性密切相关的蛋白质［24］；蛤组织表达的差异蛋白为细胞骨架蛋白［25］；中华绒螯蟹（Eriocheirsinensis）前鳃蛋白表达图谱发生差异［26］；牙鲆各组织在镉胁迫下，肝脏富集的金属的浓度最高，其浓度递增近6倍，脑组织中有24个蛋白差异表达，其中铁传递蛋白、乙酰转移酶、蛋白磷酸酶和肌动蛋白等9个蛋白的表达与镉离子浓度密切相关［27,28］；镉盐诱导海兔亚口腔神经节产生差异蛋白质，并采用蛋白质组学技术对其分离、筛选和鉴定［29］。在镉盐的胁迫下，产生的差异蛋白主要为肌动蛋白、热休克蛋白及钙结合蛋白等。
2.2在水产动物养殖及养殖环境生理方面的应用
水产动物对外界环境的变化，如温度、盐度和压力等，具有适应能力，主要通过体内生理代谢的变化维持正常的生命活动。通过差异蛋白质组学技术，找到差异的蛋白质，揭示水产动物对环境变化的生理适应机理，为养殖水环境调控提供科学的依据。张鹭等［30-33］对缢蛏（Sinonovaculaconstricta）适应环境的变化做了深入的研究，受低盐短期处理后，血淋巴显示出了至少9种差异蛋白。在高温应激下，缢蛏血淋巴内有多种蛋白发生变化，最终鉴定出2种蛋白质：锌指蛋白及IBP-CARCRchelonianin。缢蛏受高温、低盐短期处理后，缢蛏血淋巴碱性蛋白显示对温度更为敏感；就总蛋白而言，盐度压力下蛋白质浓度比温度压力下下降更快，总蛋白更少；就差异蛋白而言，小分子蛋白点的数量较一致，但高温下差异点比低盐条件下明显增多，浓度变动更加复杂。在寄生压力下，缢蛏血淋巴内有多种蛋白发生变化，主要为与炎症反应、基因表达调控、蛋白质合成等有关的蛋白。在鱼类方面，大黄鱼（Pseudosciaenacrocea）进行8.5℃急性低温胁迫处理后，肝脏16个蛋白点表达量发生显著变化，对其中的4个差异点鉴定，结果N-乙基马来酰亚胺敏感的结合蛋白、角蛋白18和2-cysperoxiredoxins表达显著下调，而肌球蛋白重链（MHC）表达显著上调［34］。在3种盐浓度（20‰、35‰和45‰）（天然海水盐度）的海水中，对文昌鱼（Branchiostomabelcheri）肌肉蛋白的表达差异进行研究，发现了3个明显的差异蛋白，分别为七鳃鳗神经肽Y前体、文昌鱼Wnt-A蛋白（片段）、文昌鱼Wnt-4蛋白（即AmphiWnt-4）。首次报道了此两种Wnt蛋白与盐胁迫下生物的生理变化有关，也为研究Wnt蛋白的功能以及分子水平研究盐度对动物的影响提供了初步试验依据［35］。Smith等［36］在研究虹鳟（Oncorhynchusmykiss）鳃细胞时，使其由等渗变为低渗过程中，鳃细胞跨内皮电阻发生变化，经双向电泳和质谱鉴定发现前载脂蛋白（pre-apoAI）差异表达显著，推测该蛋白在鱼类渗透调节过程中起着重要作用。
在水产养殖中，饵料生物较为重要。目前世界上大约有85％以上的海水养殖动物种类需用卤虫（Artemiasinica）作为其幼体饵料。卤虫的无节幼体是卤虫在水产养殖中应用最广泛的主要形式之一，可以直接简便地从幼虫卵孵化得到，是鱼、虾、蟹和牙鲆幼体的开口活饵料。本研究利用双向凝胶电泳技术，分析卤虫初孵和孵化24h后无节幼体的蛋白质组表达的变化特点，结果孵化24h的卤虫无节幼体中表达的蛋白显著多于刚孵化的无节幼体，且不同分子量范围的蛋白的表达情况存在明显差异［37］。李妍［38］利用差异蛋白质组学技术对卤虫的发育过程研究，对孵化0h、5h、10h、15h和20h的卵进行比较，出现的差异蛋白斑点分别是18个、26个、23个、16个和14个。鉴定9个明显的差异点，发现这些差异蛋白中包括一些热激蛋白、ATP合酶的B亚基、氧化还原类醛酮还原酶和未知蛋白。周茜［39］采用低温脱水的方法对中华卤虫滞育卵进行激活，结果约70个蛋白点在激活刺激后上调表达；25个下调表达；其余的蛋白点表达量基本恒定。
对其幼体受到急性硫酸铜刺激后的蛋白表达变化情况进行研究。检测硫酸铜刺激24h后卤虫幼体中14个差异表达的蛋白点，鉴定了其中的7个卤虫幼蛋白，3个蛋白上调表达，其中热休克蛋白70上调7.5倍，3个蛋白下调表达，其中精氨酸激酶下调2.8倍。另外，我们也可以通过饵料的受环境的影响来判断其捕食者的环境限制机制。如真宽水蚤（Eurytemoraaffinis）在温度、盐度变化下，体内蛋白的表达具有特异性，这些蛋白质可能参与调节非必需氨基酸含量和无机离子的转运，由此推测其捕食者挠足类分布受环境因子限制的机理［40］。
在水产动物肉质改良方面，昝堃等［41］对广东阳江和浙江乐清两地的泥蚶（Tegillarcagranosa）肌肉全蛋白进行了研究。获得差异表达蛋白质点数为26个，其中3个点仅在阳江泥蚶中表达，5个点仅在乐清泥蚶中表达，6个点在阳江泥蚶中为高表达（表达量高5倍以上），12个点在阳江泥蚶中为低表达。蛋白质组学研究结果一定程度上证明，乐清地区出产的泥蚶从营养、肉质和鲜美度方面都要强于阳江地区的泥蚶。在鱼类方面，如鳜（Sinipercachuatsi）和鲢（Hypophthalmichthysmolitrix）肌肉蛋白质组成和分布也存在明显的差异。将肌肉蛋白质组成成分和蛋白的双向电泳技术结合起来，进行蛋白质组分归类分析，可为进一步研究两种鱼肌肉肉质研究打下基础，为水产业提供有价值的参考，为鱼类养殖和肉质的改良、利用提供一个指标［42］。
另外，差异蛋白质组学技术在对一些有害水产生物的防治、阐述药物的机理等方面也是必不可少的方法。如钉螺（Oncomelaniahupensis）是血吸虫的惟一中间寄主，控制钉螺是消灭或阻断血吸虫病传播的重要手段。血水草（Eomeconchionantha）的根及根茎中提取的生物碱（Eomeconchionanthaalkaloids，ECA）有较好的杀灭钉螺作用，是一种具有开发前景的植物杀螺剂。以钉螺肝脏为样本，用差异蛋白质组学技术，探讨ECA杀螺机理。成功鉴定的11个差异蛋白质点，为进一步研究ECA对钉螺肝脏的损伤机理提供了重要线索。这些差异蛋白主要涉及钉螺生长发育、细胞通讯、信号转导及抗氧化应激损伤和防御等作用［43］。
2.3在水产动物免疫方面的应用
对病毒的免疫，彩虹病毒的一种虎纹蛙病毒（tigerfrogvirus，TFV），感染模式生物斑马鱼（Brachydaniorerio）后，鉴定出了10个TFV感染后的差异的蛋白质，对其感染机制有了初步的了解［44］。传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）对我国重要的经济养殖鱼类鳜的养殖业造成了严重影响。以黑青斑河纯（Tetraodonnigroviridis）建立ISKNV感染模型，对ISKNV感染第6天黑青斑河鲍的脾脏做蛋白质组分析，共发现有60个差异的蛋白点。通过对这些蛋白的生物信息学分析可以对其进行功能分类，了解其免疫机制［45］。石斑鱼虹彩病毒（singaporegrouperiridovirus，SGIV）感染与未被病原感染的石斑鱼胚胎细胞系（GEC）之间蛋白质表达差异，鉴定出49种病毒蛋白［46］。秦兆宇等［47］从中国对虾（Fenneropenaeuschinensis）患白斑综合征（Whitespotsyndrome）的肝胰腺中通过差异蛋白组学技术鉴定出2种差异蛋白，拓宽了对虾免疫生理研究的途径，从蛋白质水平探讨对虾发病机制，寻找有效药物靶点。Chongsatja等［48］鉴定出Taura综合征病毒（TSV）感染24h后的凡纳滨对虾（Penaeusvannamei）血细胞中与宿主防御机制相关的蛋白。并对虾黄头病毒（THV）感染斑节对虾（Penaeusmonodon）淋巴器官和凡纳滨对虾鳃的差异蛋白质组分析，同样鉴定出一些与防御机制相关的蛋白质。
在水产动物对病原菌感染方面，同样也会产生自我保护的机制。在甲壳动物中，如锯缘青蟹（Scyllaserrata）分别注射生理盐水、副溶血弧菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌。继而提取肌肉蛋白进行双向电泳，通过比较各组肌肉蛋白的双向电泳图谱获得3个差异表达的蛋白。通过质谱鉴定为Calexcitin、无翅蛋白片段、速激肽相关肽。而锯缘青蟹受到副溶血弧菌感染后，血淋巴中蛋白表达变化的情况也出现差异，发现了一个明显的差异条带，鉴定为cryptocyanin。这些差异蛋白对研究锯缘青蟹的抗病蛋白及机体的免疫防御有重要意义［49-51］。张晋康［52］、蒋昊［53］对中国明对虾免疫机制研究中发现，在注射鳗弧菌24h后,中国明对虾淋巴器官中17个差异表达的蛋白质点被成功鉴定（包括4个上调表达的蛋白质点和13个下调表达的蛋白质点）；在肝胰脏中，发现45个差异表达的蛋白质（4个上调、41个下调）被成功鉴定出，包括6个能量产生相关蛋白、4个免疫相关蛋白、22个代谢相关蛋白、4个抗氧化蛋白、7个分子伴侣、1个翻译相关蛋白和2个未分类蛋白，这些数据为理解对虾淋巴器官的功能和对虾应对病原感染的分子免疫机制奠定了基础。在鱼类研究方面，从文昌鱼对盐度、皮肤划伤应激和对细菌感染、免疫攻毒等的体液或肌肉蛋白质组中，发现了差异变化蛋白。通过比较分析，发现了文昌鱼15个免疫相关因子，对进一步确定文昌鱼相关免疫因子具有重要的参考价值［54］。三联疫苗（用溶藻弧菌、副溶血弧菌及嗜水气单胞菌3种菌经甲醛灭活后混于一起），肌肉注射于大黄鱼（Pseudoscianacrocea）。分析差异蛋白，找到了24个差异点，其中21个表达上调，3个表达下调。分析鉴定发现，其中有许多与免疫应答及炎症调节相关，尤其抗氧化蛋白酶家族成员，如PRDXI、PRDXII、PRDXIV［55］。刘国勇［56］对强、弱两种毒株的柱状黄杆菌（Flavobacteriumcolumnare）感染的草鱼（Ctenopharyngodonidellus）鳃黏液，进行差异蛋白质组学研究。结果显示出34个差异表达的蛋白点，其中发现滑动蛋白K,腺酐甲硫氨酸合成酶和假定的膜蛋白等3个柱状黄杆菌的毒力因子。
2.4在水产动物发育研究中的应用
在水产动物中应用差异蛋白质组学技术对发育的研究，主要是在模式生物上，如斑马鱼和金鱼（Carassiusauratus）。Link等［57］对斑马鱼原肠胚期外胚层和中内胚层组细胞进行比较蛋白质组研究。质谱鉴定结果中包括一些已知的细胞骨架蛋白，与斑马鱼胚胎基因表达分析的结果相互验证。还发现了一种在胚层形成中重要的蛋白Ezrin2，该蛋白在中内胚层细胞中下调，通过磷酸化作用被激活。通过对两个胚层的比较蛋白质组研究发现，蛋白质组是对转录组很好的补充，是研究早期胚胎发育的一个很有价值的分析工具。Tay等［58］对6hpf，8hpf，10hpf，12hpf，14hpf，18hpf，24hpf，48hpf，72hpf及7dpf这10个不同发育时期的斑马鱼胚胎进行蛋白质组研究，发现从6hpf到8hpf和10hpf，高丰度蛋白质的数量有显著的激增。随后直到18hpf，蛋白表达谱在邻近发育时期之间的变化很微小，之后蛋白质点发生明显改变。通过定量分析发现，胚胎发育到6hpf时双向电泳分离图谱49％的蛋白质在发育到7dpf后的双向图谱中检测到。
在金鱼研究中，Huang等［59］通过提取金鱼雌核发育单倍体和二倍体的眼睛形成期的胚胎总蛋白质并进行双向电泳分离，找出二者有显著性差异的蛋白质点，并对其进行鉴定。这些差异也许是导致单倍体发育不正常的原因。在这项研究中发现Vsx1在金鱼单倍体胚胎不表达，而在二倍体中表达，得到Vsx1基因是与金鱼眼睛空间模式形成有关的调控基因和二倍体依赖型机制的候选目标基因。喻小燕等［60］对Vsx1基因沉默，获得其引起的13个差异蛋白，这些差异蛋白质可能受到Vsx1的调控，为进一步阐明Vsx1的功能和调控机理奠定了良好的基础。金鱼的雌核发育中单倍体发育是畸形的，为了阐明单倍体的发育机制，许多学者做了研究。如张玲等［61］收集了3个不同发育时期金鱼单倍体胚胎（HE-1、HE-2、HE-3）进行雌核发育单倍体的差异蛋白质组研究。初步鉴定到了15个差异蛋白质。这些蛋白质在金鱼雌核发育单倍体的发育中起着重要作用；喻小燕等［62］利用金鱼雌核发育单倍体尾鳍出现期两个不同发育时期（W1、W2）的胚胎为材料，分析了比较蛋白质组学。结果鉴定到了与发育调控、神经发育、细胞分化等相关的12个差异蛋白质；周文新［63］在对金鱼雌核发育单倍体与二倍体31hpf（尾鳍出现期）的胚胎经双向电泳后鉴定了14个差异蛋白质点，其中包括新鉴定到的两个转录因子（常转录因子IIB和锌指转录因子Snail）和一个跟神经发育相关的蛋白质（脑衍生的亲神经因子，BDNF），该蛋白质在单倍体上表达下调可能与单倍体神经系统的发育相关。
2.5在神经研究中的应用
三七的主要成分为人参皂甙Rbl、Rgl、Re和三七皂甙R1。用三七粉提取液诱导，研究蓝斑背肛海兔（Notarcusleachiicirrosus）神经连锁诱导前后所表达的差异蛋白质，共鉴定13个差异蛋白，其中较高的匹配率蛋白质为肌动蛋白、3-羟酯酰辅酶A、ATP结合转运子和甲基转移酶12，这4种蛋白都与一些神经系统疾病有关。经R1诱导后，其神经连锁表达的差异蛋白是凋亡抑制蛋白、26S蛋白酶体、酰基辅酶A脱氢酶和甲基转移酶等。鉴定的这些差异蛋白与学习记忆、神经系统疾病有关，并为它的作用机理找到确实的依据［64］。Feng等［65］寻找神经毒剂丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）对神经伤害的毒性机理及三七皂甙是否能起到减缓神经损伤的作用。选用杂斑海兔（Aplysiajuliana）为试验材料，它经ACR毒害后，三七皂甙对AJ大脑神经节产生恢复（拮抗）过程中的差异蛋白质。大脑神经节经ACR毒害后，产生了24个差异蛋白，但经三七皂甙恢复处理后，产生了拮抗效应，消除了多数差异蛋白质的表达，使其表达量接近对照组。经过数据库检索，发现有3个蛋白质已经报道与神经系统损伤有关，分别是热休克蛋白20、磷酸丙糖异构酶和短链脱氢酶。颜利［66］还对重金属神经毒理学进行了研究，用蓝斑背肛海兔的脑神经节为研究对象，以浓度为20ppm的镉盐、铜盐及铅盐胁迫，显示出共同的差异蛋白质种类有：微管蛋白、肌动蛋白、钙离子结合蛋白、热休克蛋白及氧化还原酶等。不同的差异蛋白有ABC转运蛋白、乙酰基转移酶、孕烯醇酮、异柠檬酸脱氢酶、金属依赖的转录因子、乙酰辅酶A合成酶和细胞色素c过氧化物酶等。这些差异蛋白质之间可构成一个相互影响的神经网络，共同反映蓝斑背肛海兔受重金属诱导后神经的影响，为科学地阐明镉盐、铅盐和铜盐在神经细胞内的毒性机理研究提供新颖的标志蛋白质。河蟹的性早熟与眼柄的x-器官——窦腺复合体有关，其相当于脊椎动物的下丘脑-垂体系统。李云峰等［67］对二龄成蟹和性早熟蟹的视神经节水溶性总蛋白组图谱进行分析，分别发现115和108个蛋白质斑点。发现具有明显差异蛋白点共24个，主要集中在pH5-7。这些差异点大多数是表达差异，为河蟹的性早熟机理提供了理论依据。
3展望
水产动物差异蛋白质组学研究的重点是鉴定在某种因素影响下，如环境刺激、细菌及病毒的影响等，以及在发育过程中的蛋白质表达谱，从而从分子水平解释更多的生命现象。差异蛋白质组学为水产动物的机体免疫调节、发育、信号传导等提供了有效的技术手段，对疾病的早期诊断、环境监测及环境影响、致病机理等方面也有重要的价值。目前无论是国内还是国外，差异蛋白质组学的研究已经成为热点，而且数据库的信息对其发展非常重要，但有关水产动物蛋白质数据信息却较少。
而质谱技术的应用就是依赖大型的数据库来鉴定蛋白质，然后对其功能进行分析，但因其没有全面的数据库对差异蛋白质组学的发展造成了障碍。另外，针对数据库的一些搜索程序的设计、开发，以及蛋白功能鉴定的软件开发的滞后等也对其发展产生了影响。因此，建立全面的水产动物功能蛋白质数据库已成为目前急需和解决的课题，这对水产动物的差异蛋白质组学研究具有重要意义，而且对整个水产动物的研究也具有深远的影响。
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