嗜水气单胞菌抑控药效试验

时间：2015-12-21 01:05:27 所属分类：水产与渔业 浏览量: 277

嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila) 是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的一种条件致病菌，普遍存在于水体及土壤中。该菌在繁殖过程中能产生肠毒素、溶血素等致病因子，可引起细菌性败血症、腹水

嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila) 是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的一种条件致病菌，普遍存在于水体及土壤中。该菌在繁殖过程中能产生肠毒素、溶血素等致病因子，可引起细菌性败血症、腹水病、腐皮病等多种疾病。因此，嗜水气单胞菌已成为我国淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原菌，引起鱼类及其他水生动物多种疾病，给水产养殖业带来了严重的损失。尽管目前可应用嗜水气单胞菌疫苗预防鱼类发生该病，但因该菌血清型众多［1］，且传统弱毒疫苗存在灭活疫苗使用剂量大，机体免疫应答水平较低等原因而导致免疫效果不佳［2］。现在主要用抗菌化学药物( 主要是抗生素) 防治嗜水气单胞菌引起的疾病，不仅污染了水环境，还易引起病原耐药性增加，药物残留也威胁人类健康，所以急需研究安全环保高效的新型水产药物。中草药在我国用于防治人畜疾病已有几千年历史，在抗感染方面有其特有的优势。与抗生素相比，中草药在动物机体内不蓄积、无残留，而且由于中草药成分复杂，病原微生物不易对中草药产生耐药性，提高了抗菌效力。同时，中草药还有免疫调节、补充营养和提高生产性能等作用［3］。因此，研究中草药抗菌药物具有广阔的应用前景。高汉娇等［4］、张海宾等［5］、李茜等［6］、肖辉等［7］先后进行过中草药抑菌试验研究，表明五倍子、大黄、黄芩、黄连、连翘能够有效抑杀细菌。鉴于渔用中草药种类非常有限，如何从中草药资源库中开发更多能有效抑杀病原菌的中草药是值得深入研究的问题。因此本试验广泛选取中草药对嗜水气单胞菌进行体外抑菌试验研究，以筛选出对其体外抑制作用较好的中草药，为防治该菌引起的鱼病提供科学用药的依据。

1 材料及方法

1. 1 试验材料

试验用嗜水气单胞菌是从患病南方鲇分离并保存的嗜水气单胞菌菌株 SCL1［8］。试验用液体培养基配方为: 牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，水 1 000 mL。固体培养基为每 100 mL 液体培养基加入 2 g 琼脂。试验用中草药购自重庆市北碚区心连心大药房。试验用中草药及供试部位见表 1。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 中草药提取液的制备

将供试中草药置于 60 ℃恒温干燥箱中烘至恒重，然后各取 10 g，分别加水 200 mL 浸泡 3 h 后煎煮，沸后文火煮 30 min，滤出煎液，共煎 3 次，合并滤液，浓缩至生药含量 1 000 mg/mL，调其pH 值至中性附近，121 ℃ 高温湿热灭菌后，置4 ℃ 冰箱中保存待用。

1. 2. 2 嗜水气单胞菌菌液的制备

将嗜水气单胞菌菌株划线培养，28 ℃ 孵育过夜。取单菌落接种于肉汤培养基中 28 ℃，180 r/min 震荡过夜培养。然后吸取 200 μL 均匀涂布，37 ℃ 培养 4 h，洗下菌苔液，用麦氏比浊法测定其浓度，将菌液浓度调整为 1. 0 × 107CFU / mL，置于4 ℃ 保存待用。

1. 2. 3 抑菌作用的测淀

采用平皿打孔法，参照 《中药药理实验方法学》等文献［9 －10］在超净工作台内，向培养皿( 直径为 9 cm) 内倒入培养基，每种药液用 3 个平板作平行试验。用棉签蘸取菌液均匀涂抹于固体培养基上，待 菌 液 干 后，然 后 用 打 孔 器 ( 直 径 为6. 00 mm) 在每个平板上打 4 个孔，做好药物标记。其中3 孔加入 50 μL 药液，另外一孔以灭菌生理盐水为阴性对照。将平板置于 28 ℃ 培养箱中培养24 h。观察并用游标卡尺测量抑菌圈的直径，结果取 3 个平板的平均值。参照最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的结果，抑菌圈直径小于 10 mm 为无抑菌作用，用 “－ ”表示; 10 ～15 mm 为抑菌作用弱，用 “+ ”表示; 15 ～ 20 mm 表示抑菌作用中等，用 “+ + ”表示; 大于 20 mm 表示抑菌作用强，用 “+ + + ”表示。

1. 2. 4 最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法［10］测定。每种药物准备 14支灭菌 的 带 棉 塞 10 mL 试 管，向 第 一 管 加 入1. 5 mL菌液，其余各管均加入 1 mL。第 1 管内加入中草药药物原液 0. 5 mL，混合均匀后吸出 1 mL加入第 2 管中，同法依次稀释至第 12 管，弃去1 mL，第 13 管为只加菌液不加药液的生长对照，第 14 管为只加药液不加菌液的空白对照。每管总量为 1 mL，每种药物重复 3 次，置于 28 ℃震荡培养箱内培养24 h。然后观察结果，清澈透明无混浊现象的试管即为无菌生长试管。无菌生长试管中的最低药物浓度即为最小抑菌浓度( Minimal InhibitoryConcentration，MIC) 。

1. 2. 5 最小杀菌浓度的测定

在 MIC 试验基础上继续培养 24 h，观察结果，清澈透明无混浊现象的试管即为无菌生长试管。无菌生长试管中的最低药物浓度为最小杀菌浓度( Minimal Bactericidal Concentration，MBC) 。

2 结果与分析

2. 1 中草药提取液的抑菌圈大小

所选中草药对嗜水气单胞菌的抑菌活性各不相同。所选 100 种中草药中抑菌作用强的有诃子和秦皮，抑菌圈非常明显( 图 1) ，直径分别为( 21. 92 ±0. 86) mm 和( 20. 14 ± 0. 04) mm，抑菌作用中等强度的有香薷、升麻、红藤等 13 种，雷公藤等 33 种中草药表现为低抑菌作用，牛蒡子等 52 种中草药无抑菌作用( 表 2) 。

2. 2 中草药对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

选取抑菌圈直径大于 10 mm 的药物进行 MIC和 MBC 的测定，试验结果见表 3。诃子对嗜水气单胞菌的抑菌作用和杀菌作用最强，MIC 和 MBC均为3. 91 mg/mL，其次是秦皮，均为7. 81 mg/mL。红藤等 35 种中草药有一定的抑菌和杀菌作用，MIC 和 MBC 介于 31. 25 mg / mL 与250. 00 mg / mL之间; 其余中草药无明显的抑菌和杀菌作用，MIC 和MBC 均大于250. 00 mg / mL。

3 讨论

本实验结果表明，在试验条件相同的情况下，诃子和秦皮的抑菌效果最好，其抑菌圈直径达20 mm以上，MIC 和 MBC 相同，分别为 3. 91 mg /mL( 诃子) 和 7. 81 mg / mL( 秦皮) ; 红藤等 46 种中草药有一定的抑菌和杀菌效果，抑菌圈直径在10 ～ 20 mm之间，除草叩等 11 种中草药的 MIC 和MBC 大于 250. 00 mg / mL 之外，其余中草药的 MIC和 MBC 介于 31. 25 ～250. 00 mg/mL; 牛蒡子等 52种中草药无抑菌作用。不同研究者报道诃子和秦皮对嗜水气单胞菌的 MIC 和 MBC 各不相同，如喻运珍等［11］报道诃子的 MIC 为 0. 12 μg/mL，罗新等［12］试验的 MIC 和 MBC 都是 15. 625 mg/mL，彭金菊等［13］报道诃子的 MIC 为 6. 25 mg/mL，MBC为12. 5 mg/mL，而本实验结果介于上述报道结果之间，即 MIC 和 MBC 均为 3. 91 mg/mL。秦 皮 也有类似情况，彭金菊等［13］报道秦皮的 MIC 和 MBC分别为12. 50 mg/mL 和25. 00 mg/mL，而本实验显示秦皮的 MIC 和 MBC 为 7. 81 mg/mL。在其它具有抑菌作用的中草药中，穿心莲、白头翁、青蒿、桂枝、柴胡、射干、大黄、苦参、天南星和钩藤 10 种中草药已见报道。本研究发现穿心莲的 MIC 为 250 mg/mL，与喻运珍等［11］报道的完 全 一 致。 而 白 头 翁 的 MIC 和 MBC 均 为125 mg / mL，低于彭金菊等［13］报道的 200 mg/mL，与张海宾等［5］的结果( MIC 和 MBC 均大于 0. 5 mg/mL) 有差异。同时青蒿、桂枝、柴胡和射干的研究结果与彭金菊等［13］的报道也有差异。本研究显示大黄抑菌圈直径为 ( 15. 89 ±0. 32) mm，苦参为( 13. 18 ±0. 17) mm，略高于肖辉等［7］报道的结果，对嗜水气单胞菌有中等抑菌作用; 本研究显示天南星和钩藤的抑菌圈直径为 0 mm，而肖辉等［7］报道天南星的抑菌圈直径为( 9. 37 ± 0. 94) mm，周飞等［14］报道钩藤为( 11. 31 ±0. 15) mm。这些差异可能与本实验将中草药原液的 pH 值调至中性附近有关，有研究表明 pH 值的调节对抑菌效果的影响很大［12，15］。此外，也可能与细菌株不同、药物的采集地、采集季节、使用部位、植物年龄、贮藏炮制方法等有关［16］。中草药对细菌有抑制作用，说明其含有某些抑菌成分。诃子主要含没食子酰葡萄糖类、没食子酰的简单酯类化合物等［17］。现代药理研究表明，诃子属于鞣质类中草药物，鞣质类中草药物具有收敛、止血、抗菌作用［18］。Sato 等［19］研究发现从诃子果实提取物中分离纯化的没食子酸及其乙酯有很强的抑菌作用。秦皮中的秦皮甲素、秦皮乙素为抑制病原微生物的有效成分［20］。Duncan 等［21］研究了秦皮乙素等香豆素类化合物对动物内脏细菌的抑制作用，结果表明秦皮乙素具有明显的抑菌作用。本实验结果表明诃子和秦皮对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果最好，香薷、升麻、红藤等 46 种中草药也有较强抑菌效果，为使用这些中草药治疗水产养殖中的细菌性疾病提供了依据。中草药抑菌活性成分在离体和在体两种条件下的杀菌效果可能相差较大，在体消化液、酶、激素等化学成分对其抗菌效果都有影响［22］，从而出现了有些中草药体内外抗菌效果并不一致的现象，如魏振装等［23］报道在其所选的 85 种体外具有抑制大肠杆菌作用的中草药中只有大飞扬等 7 种可明显提高动物存活率。所以，这些体外抑菌试验中表现出较好抑菌效果的诃子、秦皮等 48 种中草药能否对嗜水气单胞菌病的防治有效，还应进一步进行在体试验研究。

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