双向电泳技术在作物雄性不育研究中的运用

时间：2015-12-21 01:03:48 所属分类：畜牧 浏览量:

近年来，随着蛋白质组概念的提出[1]，蛋白质双向电泳技术越来越受到大家的关注， 该技术尤其是在作物雄性不育研究方面应用较多。 蛋白质组学的关键技术是双向凝胶电泳-质谱分析技术，该技术通过双向电泳对蛋白质进行分离， 实现对蛋白的定量研究， 后期与质

　　近年来，随着蛋白质组概念的提出[1]，蛋白质双向电泳技术越来越受到大家的关注， 该技术尤其是在作物雄性不育研究方面应用较多。 蛋白质组学的关键技术是双向凝胶电泳-质谱分析技术，该技术通过双向电泳对蛋白质进行分离， 实现对蛋白的定量研究， 后期与质谱鉴定相结合， 实现蛋白的定性分析，最后还可利用数据库对蛋白进行具体的鉴定，确定蛋白的种类、功能等[2-3]。 因此，结合双向电泳技术，从蛋白质组水平研究作物雄性不育机理， 寻找与育性相关的蛋白质，进而找到相应的不育基因，对研究作物雄性不育具有重要的理论和实践意义。

　　1 蛋白质组学研究方法

　　蛋白质组学研究的常规方法是提取全蛋白，经双向电泳分离形成一个蛋白质组的二维图谱， 通过计算机图像分析得到各蛋白质的等电点、分子量、表达量等，再用质谱分析进行蛋白质鉴定，建立“正常生理条件下”蛋白质图谱和数据库。 在此基础上，可以比较分析不同条件下的蛋白质组所发生的变化，如蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰、蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等， 从而发现和鉴定出特定功能的蛋白质及其基因[2，3]。 蛋白质组研究分析通常有 3 个步骤，第一步，运用双向电泳技术分离样品中的蛋白质；第二步，应用质谱技术或 N 端测序技术鉴定双向电泳分离的蛋白质；第三步，应用生物信息学技术储存、处理比较获得的数据。

　　1.1 蛋白质双向电泳技术

　　1956 年 ，Smithiea 和 Poulik 发明了双向电泳 ，1975 年， O'Farrell 对其做了改进， 并建立起了双向凝胶电泳技术体系[4]，1975 年 Gasparic 等合成了固相pH 介质[5]，通过近 40 年的发展 ，双向电泳技术已逐步成熟完善，但其基本原理并未改变，即根据蛋白质等电点和分子量的差异，进行双向电泳，第一向是等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）,第二向是聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）, 这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上，从左到右是等电点的增加，从上到下是分子量的增加。

　　双向电泳一次可以分辨出 1 000～2 000 个蛋白质，有些甚至可以分辨出 5 000～10 000 个斑点[6-9]，而且同时获得该蛋白质的等电点和分子量。 固向化 pH 梯度（Immobilized pH gradient,IPG）的发明和完善，使双向凝胶电泳的重复性和上样量得到了改善， 而与双向凝胶电泳相结合的新型凝胶染色技术， 如荧光染色的开发，使其分辨率大大增加。

　　1.2 质谱技术

　　质谱技术是近年来蛋白质组学研究中最重要的技术突破之一，其原理是将样品分子离子化，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定质量。 质谱测定中首先将通过 2-DE 分离到的蛋白质用特定的蛋白质酶消化成肽段，然后用质谱仪进行分析[2,3]。 基质辅助激光解吸质谱技术 （Matrix-assisted Laser Des-orption Ionization, MALDI） 和电喷雾质谱技术（Elec-trospray Ionization ,ESI）的发明，使得传统的主要介于小分子物质的有机质谱技术取得了突破性进展。 这两项技术具有高灵敏度高通量和高质量的检测范围等特点，使得在 pmol（10-12）甚至 fmol（10-15）的水平上准确地分析分子量高达几万到几十万的生物大分子成为可能[2]。

　　1.3 生物信息学数据库

　　由于 Interent、 大型服务器和广泛的计算机的参与，蛋白质组的研究效率和精确度大大提高[2]。 对蛋白质进行双向凝胶-质谱分析后，如需最终确定蛋白的种类， 则需要查询蛋白质数据库[3]， 目前已有MELANIE、PDGVEST 等软件，可自动迅速地完成 2-DE 凝胶图像，进行图形处理，斑点检查与量化、背景过滤、2-DE 的匹配与比较，以及统计分析工作。 这些1预测潜在的翻译后调节方式和三维结构[2,7,9]。 蛋白质数据库是蛋白质组研究水平和能力的标志。 到目前为止， 与蛋白质有关的数据库占生物学数据库总数的半数以上，由此可见，生物信息学与蛋白质组研究关系密切。

　　2 双向电泳技术在作物雄性不育研究中的应用

　　目前， 双向电泳技术已广泛应用到作物雄性不育研究中，并找到了一些与育性相关的蛋白。 水稻、小麦、大豆等作物的不育相关蛋白研究表明，不育系与保持系的叶片之间的蛋白质几乎没有差异,种子间仅有少量差异，而花药之间有比较大的差异,说明不育基因表达具有时空性和器官特异性。 即与育性有关的蛋白不在营养器官中表达， 而主要在花药中表达[10]。

　　2.1 双向电泳技术在水稻雄性不育研究中的应用

　　曹以诚等对光敏核不育水稻花药蛋白双向电泳表明， 处于 14 h 长日照下的光敏核不育农垦 58S 二核花粉期蛋白比处于 9 h 短日照育性正常二核花粉期蛋白缺少一组蛋白， 这组蛋白很可能与育性表达有关[11]。 王台等对光周期敏感核不育水稻叶绿体的特异性蛋白研究发现，无论内外环境如何，农垦 58S 的叶绿体内均有 45kDa 和 61kDa 的特异性蛋白质，而农垦 58 没有，认为这两种特异蛋白可能和育性转换有关[12]。 谢锦云等对温敏核不育水稻的不育和可育花药样品进行双向电泳分离、 质量指纹图谱分析及数据库检索，在不育到可育图谱上，明显上调的蛋白质包括几丁质酶、酸性磷酸酶、谷蛋白前体等，明显下调的蛋白有谷氨酸氨甲酞转移酶等[13]。 文李等对红莲型细胞质雄性不育水稻的不育系 （YTA） 和保持系（YT T3）单核花粉总蛋白质进行分离 ，得到 85 个差异表达蛋白质，初步鉴定出 9 个蛋白质点，这些蛋白的缺失或表达量降低可能导致能量供应不足、 淀粉合成受阻，因而花粉不能正常发育[14－15]。

　　2.2 双向电泳技术在小麦雄性不育研究中的应用

　　门淑珍等取小麦“京 411”不育株（Ms2）和可育株处于减数分裂期的花药进行双向电泳， 发现不育花药比可育花药缺少相对分子量分别为 15.8 ,17 ,17.8,38 ,81. 3 kD 的几个多肽， 不育系花药比可育花药多一个相对分子量为 16.2 kD 的酸性蛋白,其等电点约174.1 kD） 的多肽上， 可育花药的蛋白斑点浓于不育花， 说明可育花药中这几种蛋白的含量高于不育花药[16]。 范宝莉等在小麦 T 型细胞质雄性不育系与保持系蛋白质双向电泳比较研究中发现在花粉败育的关键时期一二核小孢子期， 小麦细胞质雄性不育系有53 kD/pI5.5 50 kD/pI 5.7,48 kD/pI 5.6 和 20 kD/pI7.5 共 4 种蛋白组分存在，而保持系中没有[17]。 刘卫等对遗传型不育系 ms （S）-西农 1376、 对应的保持系（A）-西农 1376 和生理型 （化学杀雄剂 SQ-1 诱导）雄性不育系 ms （A）-西农 1376 为材料, 利用 IEF/SDS-PAGE 凝胶电泳技术, 对发育到单核后期的花药全蛋白特异性进行了比较分析, 得到 320～350 个清晰的蛋白点，认为遗传型和 SQ-1 诱导的生理型不育系蛋白质图谱与正常保持系在蛋白质（多肽）表达量上存在一定的差异, 同时发现有几种蛋白质的表达有明显的特异性, 两个不育材料 2D 胶上共有几个明显的特异蛋白点, 而在保持系中未发现; 两个不育材料又分别具有自己的特异蛋白表达, 不育机理不同; 不育系中某些蛋白的表达受到了抑制, 并开启了与花药败育有关的特定蛋白的表达[18]。

　　2.3 双向电泳技术在大豆雄性不育研究中的应用

　　曾维英利用蛋白质组学技术对大显质核互作雄性不育系 NJCMS2A 及其同型保持系 NJCMS2B 花药进行蛋白质组比较分析, 在二胞花粉期花药 2-DE 图谱上分别检测到约 217、 214 个蛋白点， 两系间有25 个差异表达蛋白点， 其中 13 个在 NJCMS2A 中表达，而在 NJCMS2B 中缺失，10 个在 NJCMS2A 中缺失而在 NJCMS2B 中表达，2 个在 NJCMS2A 中表达量明显下调。 在 NJCMS2A 与 NJCMS2B 的单核小孢子期花药 2-DE 图谱上分别检测到约 193、192 个蛋白点，两 系 间 有 16 个 差 异 表 达 蛋 白 点 ， 其 中 9 个 在NJCMS2A 中 表 达 而 在 NJCMS2B 中 缺 失 ，7 个 在NJCMS2A 中缺失而在 NJCMS2B 中表达[19,20]。

　　3 存在问题

　　蛋白质样品制备的优劣将直接影响 2-DE 结果，是试验成败的关键步骤之一。 由于植物细胞含有很厚的细胞壁和多种次生代谢物质，因此，蛋白的提取相对比较复杂。 目前常用的蛋白质提取和沉淀方法主要有尿素/硫脉法、TCA/丙酮、醋酸铵沉淀法、酚提取等方法，其中 TCA-丙酮沉淀蛋白是利用双向电泳技术分离植物蛋白质最常用的方法。 它的优点在于在沉淀蛋白的同时，抑制了蛋白酶的活性，并去除一些干扰物质。 但 2-DE 还是有很多不足之处，它不易检测出低拷贝的蛋白、极酸或极碱的蛋白质、分子量极大或极小的蛋白质以及难溶的蛋白质， 有时一个蛋白点含有不止一种蛋白，重复性仍然不理想等，需要进一步的改进。

　　4 展望

　　蛋白质组研究不仅可以作为现有基因组功能研究的鉴定和补充， 也为不育基因的研究开辟了新的道路。 植物雄性不育的蛋白质组学研究成果说明了雄性不育的育性转换与某些特异蛋白相关， 包括蛋白质的表达上调、下降、缺失或者一些蛋白的新增，也获得了一些与雄性不育育性转换相关的蛋白，并运用质谱分析初步确定了蛋白， 但对这些蛋白在作物雄性不育的育性转换过程中的作用机理还不清楚，因此，需要与转录组研究结果相结合，把蛋白质与基因联系起来， 能更好地揭示植物雄性不育的分子机理。

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