时间：2015-12-21 00:37:00 所属分类：园艺 浏览量:
兰科（Orchidaceae）植物是最大且分布最为广泛的有花植物之一，有地生、附生及腐生等多种生态（生境）类型，多数为珍稀濒危植物，具有很高的观赏和药用价值。如天麻、铁皮石斛等为我国传统中药，有些种类如蝴蝶兰、卡特兰等则因其花形、花色千姿百态，绚丽夺
兰科（Orchidaceae）植物是最大且分布最为广泛的有花植物之一，有地生、附生及腐生等多种生态（生境）类型，多数为珍稀濒危植物，具有很高的观赏和药用价值。如天麻、铁皮石斛等为我国传统中药，有些种类如蝴蝶兰、卡特兰等则因其花形、花色千姿百态，绚丽夺目而常用于插花观赏[1-2].兰科植物种子细小如尘，发育不完全，仅具尚未分化的原胚，自然条件下需与合适的菌根真菌共生才能萌发。
兰科植物自然生境的破坏和资源的过度开采，加上其极低的自然繁殖率，致使野生资源在原始生境的恢复异常困难，野生兰科植物极度濒危。濒危兰科植物的再生和合理利用有赖于种苗快繁技术的蓬勃发展，而该技术的核心问题之一便是种子萌发。研究兰科植物种子萌发的相关培养条件（温度、光照、培养基组成、共生萌发真菌等）和共生萌发机制（生化、营养、分子等方面）以及种子成熟度、预处理与萌发率的关系，将对兰科植物种苗快繁途径中有性繁殖技术的发展起到促进作用，从而为兰科植物资源的可持续利用提供理论依据。
1 种子成熟度与萌发率
影响种子室内萌发的因素有水分、氧气、温度、光照、培养基组成及种子成熟度等。
种子成熟度是影响种子萌发的关键因素之一。但并不能简单地认为成熟种子的萌发率要高于未成熟种子，因为当种子达到某成熟度之后，种子成熟度的增加将不 再 显 着 提 高 萌 发 率，甚 至 有 可 能 会 降 低 萌 发率[3-6].例如Calanthe tricarinata在授粉150d后形成种子最适宜无菌萌发，因为此时种胚长至最大尺寸，种皮开始脱水，并逐步缩至薄薄的一层；而授粉180d后的种子萌发率明显低于授粉150d后的种子。研究发现，内源性脱落酸浓度随着种子成熟度的增加而增加，而高浓度的脱落酸是公认的阻碍种子萌发的因素，这可能是导致出现该现象的原因之一[7].不同培养条件下，不同成熟度的种子萌发率不同。
Spathoglottis plicata人工授粉4~5周和8~9周后形成的种子分别在3种不同培养基上非共生萌发，其中Phytamax（PM）培养基附加2%（w/v）蔗糖及2.0g/L的蛋白胨最适合授粉8~9周后的种子萌发，而添加了1.0mg/L 6-BA的P723培养基最适合授粉4~5周后的种子萌发，但不利于授粉8~9周后的种子萌发[8].播种时种子的成熟度影响着播种培养基的选择和预处理的方式，所以了解种子成熟度与种子萌发之间的关系可为后续播种方案的选择和缩短繁殖周期等提供参考。
2 种子收集与预处理
2.1种子收集
收集和有效保藏种子是实现兰科植物种质资源持续利用的前提。通常的做法是在超净工作台上，先对即将开裂却未开裂的蒴果进行表面消毒（70%~75%乙醇1min,2.5% NaClO 15min），接着用无菌水冲洗数遍，然后用无菌滤纸吸去多余水分，最后用无菌手术刀沿着蒴果腹缝线将其划破，取出种子。乙醇、NaClO的浓度和消毒时间可依据蒴果大小等酌情处理，使用的先后顺序也可视具体情况调节[9-10],其中NaClO可用过氧乙酸或HgCl2代替。
2.2种子预处理
播种前，对种子进行预处理可以促进萌发，这是因为兰科植物种子种皮中存在着萌发抑制物质（如木质素[11-12]），或种皮本身阻碍了种子对水分和氧气的吸收，所以为了促进萌发，物理上一般采用磁性棒搅拌或超声波法去除种皮对种子萌发的抑制[13],化学上则用NaOH、KOH、NaClO及Ca（ClO）2等溶液来破坏种皮并起到消毒作用。除此之外，有的种子在萌发前需经过后熟作用，所以低温层积也是常用的预处理方法之一[14-15].
通过上述处理可显着提高兰科植物种子共生萌发的萌发率，陆生兰（Epipactis palustris）种子即使与适宜的真菌共生萌发，萌发率也非常低，除非对种子进行预处理：用Ca（ClO）2划破外种皮，随后在4~8℃下低温层积8~12周。因为自然条件下，该种子的原地萌发、真菌侵染均发生在初春，它在萌发前需经过后熟作用，且外种皮的部分分解有利于水分吸收和真菌侵染[16].除此之外，低温层积预处理还可促进Platan-thera praeclara、P.leucophaea种子的共生萌发[17-18].对于兰科植物种子的非共生萌发，除可采用上述预处理方法外，还可用适宜浓度配比的激素混合液浸泡处理。如将Calanthe discolor种子放在含有萘乙酸（NAA）1~100mg/L,乙 烯 磷1 000mg/L,6-BA 10mg/L或100mg/L的溶液中浸泡7d后再播种在不含激素的无菌培养基上，发现能促进该种子萌发[19].目前，有关激素促进兰科植物种子萌发的机制尚不清楚。
3 非共生萌发
兰科种子非共生萌发的培养条件主要包括温度，光照（光源、强度、时间），气压（压强、气体成分及比例），基本培养基及植物激素（植物生长素类、细胞分裂素类及其浓度配比），碳源（蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等），氮源，活性炭的添加，天然有机提取物（马铃薯汁、香蕉汁、椰子汁等），pH值等。
3.1温度
兰科植物种子的培养温度一般控制在20~30℃,大多数以25℃为宜。一般情况下，兰科植物种子在此温度范围内均能萌发，但每一物种均有其最适温度。
例如霍山石斛（Dendrobium huoshanense）种子在26~29℃时的萌发率明显优于24~26℃和18~21℃[20].
3.2光照
有报道称，兰科植物种子的感光不是必需的而是光促进类型[21].总体而言，兰科植物种子有些需要完全暗培养，而有些需要光暗交替培养，且光照周期因种而异。光照对种子突破种皮这一阶段影响不大，如已萌发至原球茎，必须给予适当的光照，原球茎才能继续发育成幼苗。研究发现：在无菌萌发试验中，完全暗培养一段时间后给予光暗交替培养是春兰（Cymbidiumgoeringii）启动种子萌发所必需的，全光照或全黑暗条件下种子均不萌发[22].此外，Bae等研究了不同光源（蓝光、红光LED）对Oreorchis patens无菌萌发的影响，发现这两种光中，红光LED更适宜此物种的种子萌发[23].
3.3气压
理论上，培养兰科植物种子的气压条件与它的野外生境越接近越好，这需要不断的探索。研究发现，当气压增至1.8atm时能促进Galeola septentrionalis种子萌发，而此时O2和CO2的最佳浓度分别为5%、8%[24].如条件允许，可深入研究并将其与气候变化相结合。
3.4基本培养基及植物激素添加
兰科植物种子非共生萌发的基本培养基多为1/2MS、MS、VW、KS、SH、KundsonC、N 6、PT、Hyponex1、Hyponex 2;在碳源方面，蔗糖最好，半乳糖对胚的生长有抑制作用。蔗糖作为培养基中的能源物质和渗透调节剂，对原球茎的生长影响较大，一般在培养基中添加2%~3%.有研究证明，2%的蔗糖有利于兰属原球茎的生长。此外，在培养基中添加活性炭可以有效吸附酚类物质，从而减少褐变[25-27].氮源方面，兰花胚在含有氨盐的培养基上生长良好，它对氨盐的亲和力是与兰花特有的营养习性有关，对某些兰科植物种胚而言，尿素是有效的氮源，但对另一些种来说却具有抑制作用[2].天冬氨酸和精氨酸在培养兰科植物离体胚时，作为培养基中的氮源是非常有效的[28].
有些兰科植物种子非共生萌发困难，可以通过添加植物激素在一定程度上来克服，目前常使用的外源激素是生长素类（如IAA、2,4-D和NAA）、细胞分裂素类（如6-BA、ZT和KT）和赤霉素（GA）；激素可单一添加也可配合使用，其中单一添加某种激素时有限的促进效果 暗示了兰科植 物种 子萌发机制 的复杂性[19],而不同类别激素的配合使用往往能有较为明显的促萌发作用。研究发现，较高浓度（1.0mg/L）激动素（KT）与较低浓度（0.1mg/L）NAA的配合使用对佛手参（Gymnadenia conopsea）种子的非共生萌发具有明显的促进作用[29].种子萌发研究初期离不开最适培养基的筛选。王建勤等就曾分别用VW、KC、MS及改良的VW、MS、KC对金线莲（Anoectochilus roxburghii）种子进行无菌萌发，发现种子在KC和改良的MS培养基上萌发率最 高，但KC培 养 基 上 的 原 球 茎 较 早 就 出 现 衰老。[30]
3.5天然提取物的添加
在种子无菌萌发培养基中添加适宜的天然提取物能促进种子萌发，这一结论已得到众多论证：Pierce等发现，豌豆种子提取物能刺激Ophrys apifera种子的萌发[31];Malabadi等发现，在培养基中添加一定量的烟饱和水能促进Oberonia ensiformis和Xenikophy-ton smeeanum种子的无菌萌发，原因是由于烟饱和水中的丁烯酸内酯能促进种子萌发[32-33].然而，如果培养基中添加了不适宜的天然提取物，不但不会促进萌发，还会起到反作用。如在培养基中添加一定量的马铃薯汁可促进铁皮石斛（D.officinale）种子萌发，而添加香蕉提取物和椰乳则对其有不利影响[34].对某些物种而言，添加激素的促萌发效果不如添加天然提取物。如在Orchis purpurella种子无菌萌发试验中，无论是单独使用激动素（KT）还是和IAA结合使用，都对原球茎的生长和发育有显着的影响，但其促进效果都不如添加马铃薯汁或椰子汁[35].
3.6 pH值pH值影响着种子萌发过程中各种合成分解酶的活性，适宜的pH值能提高种子萌发率。
pH 5.0~5.8的环境最适宜兰科原球茎的生长，过酸或近中性环境都不适合。Prakash等曾研究了4个梯度的pH（3.5、4.5、5.5和6.5）对Vanda tessellata种子无菌萌发的影响，发现pH=5.5时，萌发效果最好，萌发率最高，在培养30d后，就已经达到60%的萌发率，继续培养至90d,萌发率达到最高值95%左右，而pH=3.5或6.5时，在培养90d后仍没有萌发现象，而在pH=4.5时，培养60d的萌发率才达到20%左右，而在90d时，此pH值下培养的种子全部死亡[36].
4 共生萌发 Bernard在1899年首次认识到真菌的作用，认为自然条件下真菌对兰科植物种子的侵染是种子正常萌发所必需的，兰科植物种子与真菌之间是一种共生关系，由此创立了共生萌发法[25].
4.1促进兰科植物种子萌发的真菌（共生萌发真菌）
促进兰科植物种子萌发的真菌都是其菌根真菌，这些真菌在分类上属于丝核菌属（Rhizoctonia）成员，其有性型分属于角担菌属（Ceratobasidium）、胶膜菌属（Tulasnella）和蜡壳菌属（Sebcina）[37].大量实验表明，无论是从初始萌发时间、萌发率、所能萌发至的级别，还是原球茎后期发育来看，共生萌发明显优于非共生萌发[38].
一般来讲，获得促进兰科植物种子萌发的真菌主要有两种途径，其一：组织分离的方法，即从宿主植物原球茎、幼苗根、成年植株根内甚至是茎叶中分离得到内生真菌，通过真菌与兰科植物种子共培养实验确认其是否为促种子萌发真菌；其二：采用原地共生萌发技术，用种子袋的方式在野外原地萌发，种子萌发至原球茎或长成小苗后，再从该原球茎或小苗中分离得到，即所谓的种子诱导[39].
兰科植物种子与其菌根真菌的专一性关系国内外进行了大量的研究但一直存在争议。用分离自非兰科植物 的 丝 核 菌 属 真 菌 与Spiranthes sinensis var.amoena种子共生萌发，发现大部分都能使其萌发，从而表明了兰科植物种子与其共生萌发真菌之间存在较低特异性，并没有严格的专一性[40].研究发现，完全靠真菌异养的Cyrtosia septentrionalis对共生萌发真菌是低特异性，而且试验表明共生萌发真菌不与种子直接接触也能促进其萌发，这说明促萌发信号的传递在它们物理接触之前就已经发生，可能的原因是共生真菌产 生 了 某 种 挥 发 性 物 质 刺 激 了 种 子 萌 发[41].
Patagonia地区的陆生兰Gavilea australis与共生萌发真菌之间专一性程度较低[42].此外，在原地和在实验室条件下，Rhizoctonia spp.与Spiranthes sinensisvar.amoena之间的专一性有差异。自然条件下，这两者之间具有严格的专一性，称作生态专一性。而在实验室条件下，多种Rhizoctonia菌株均可促进其种子萌发，表明宿主植物与真菌之间存在潜在专一性。专一性的研究有赖于真菌分离技术，许多存在于根表面和根被中的真菌能从表面消毒的根中分离出来，并能在实验室条件下促进种子萌发，但这只能说明它们具有潜在专一性，还需在自然条件下检查其生态专一性[43].
4.2培养条件
兰科植物种子共生萌发培养条件主要包括温度、光照、培养基。而培养基的组成主要考虑以下几个方面：第一，不提供种子萌发所需物质但能使共生萌发真菌正常生长；第二，pH值；第三，琼脂用量，太多影响种子对水分的吸收。
兰科植物种子共生萌发试验多采用在2.0~3.0g/L燕麦培养基（OMA）上播种与接菌，但天麻种子一般采用菌叶播种法：在培养皿中，将长满或将近长满共生萌发真菌的壳斗科树叶方片（菌叶）放置在浸有无菌水的海绵上，再在菌叶上播种。此外，还可用水琼脂培养基代替浸水的海绵[44].兰科植物种子共生萌发过程中对温度很敏感，温度一般介于20~28℃之间，像Dactylorhiza majalis种子萌发的效果十分依赖于温度，在最佳温度范围23~25℃之外时，萌发率显着下降[45].光照刺激和黑暗对于多数兰科植物种子室内共生萌发是必需的，但具体的光照条件依属种不同而不同[46-47].
4.3共生萌发机制
兰科植物种子接菌共生萌发包含着种子萌发和植物与微生物间相互作用双重过程，是极具复杂性和挑战性的。共生萌发涉及共生和萌发两个方面，有其复杂性。种子微小，不容易进行实验操作，高活性促萌发真菌的获得及实验方法的受限等都曾是限制共生萌发机制研究的因素。
4.3.1营养方面
自然条件下，能够促进真菌异养型兰科植物种子萌发的真菌多是外生菌根真菌，这类真菌通过与邻近的树木形成外生菌根关系，从而获得营养提供给种子萌发。兰科植物、真菌、树木三者之间就形成了共生网络，在兰科植物种子共生萌发过程中，菌根真菌通过与兰科、其他树种的共生作用，可以将其他树种中的碳源转 运 给 兰 科 植 物 种 子[48]. 如 真 菌 异 养 型 植 物Rhizanthella gardneri,它可以通过菌根真菌直接吸收土壤中的碳源、氮源等营养物质，也可以通过菌根真菌与自养型灌木组成三角网络来获得所需养分[49].在共生萌发过程中，共生萌发真菌能够促进种子对自由水分子的吸收，从而提高萌发效率[50].共生萌发真菌还能利用纤维素得到碳水化合物并转移至原球茎中，纤维素是温带和热带兰科-真菌共生系统中极好的碳源，能够进一步加快原球茎的发育[51].
4.3.2生化方面
在探讨IAA对兰科植物种子共生萌发的影响时，澳大利亚研究人员曾在燕麦培养基上添加与当地兰科植物有联系的产IAA的几种细菌稀释液，然后再接种真菌播种，发现有的细菌稀释液对种子萌发起促进作用。假设IAA能促进兰科植物种子共生萌发，那么此时的IAA可能是细菌产生的，也有可能是细菌或真菌代谢物诱导种子产生的内源性激素[52-53].lusianthrin和chrysin是2种 只 针 对 非 病 原Rhizoctonia spp.的 抗 真 菌 化 合 物，它 们 参 与 了Cypripedium种子与R.spp.的共生萌发，在此过程中R.spp.
一直试图侵入植物细胞质中去获取营养，植物细胞则通过消化菌丝获取营养并约束着菌丝的侵染，抗真菌物质极有可能参与了此时的反侵染，但这2种化合物作用于植株生长发育的不同阶段，lusianthrin主要作用于种子萌发阶段，而chrysin主要作用于成年植株阶段[54].
4.3.3分子机制
兰科植物种子萌发的分子机制目前少有报道。植物种子萌发分子机制相关报道主要来自对水稻、拟南芥等模式植物的研究。在拟南芥中，由小基因家族（PhyA-PhyE）编码的光敏色素通过介导GA的生物合成和对GA的敏感性来影响种子萌发，而光敏色素结合蛋白（phytochromekinase substrate 1,PKS 1）和细胞核因子中的PIL 5是其调控途径中的负调控因子。
GA能够调控许多与萌发相关的酶，如磷酸酶、β-葡聚糖酶，而ABA则通过介导GA调控的相关转录进而调控种子萌发。其中，编码9-顺-环氧类胡萝卜素-双加氧酶的基因家族AtNCED和编码ABA 8′-羟化酶的基因家族CYP 707A对拟南芥中ABA的合成分解有着明显的调控作用。而在拟南芥GA调控途径中，AtGA 20ox 1、AtGA 20ox 2、AtGA 3ox 1、AtGA3ox 2及SLY 1基因的表达起到正向调控作用，而RGL 2和SPY的基因产物是其负调控因子。
G蛋白偶联受体（GCR）是感受外界信号的主要成分之一，在拟南芥中可能参与GA信号的转导，并起到正调控作用[55].近几年有研究者尝试着探索兰科植物种子共生萌发的分子机制，并取得了一些进展。
赵明明等采用抑制差减杂交（SSH）技术，分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子，构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库，从而得到铁皮石斛种子接菌共生萌发差异基因表达谱[56].实验中检测到编码脯氨酸、天冬酰胺合成酶以及半胱氨酸蛋白酶等的基因在种子接菌共生萌发中差异表达，并用qPCR分析验证了基因Do-1110（编码半胱氨酸蛋白酶）和Do-131（编码天冬酰胺合成酶）均显着上调表达，暗示氨基酸类代谢调控相关基因可能在铁皮石斛种子接菌共生萌发过程中起作用。研究还发现，编码亮氨酸重复受体蛋白激酶（LRR-RLK）的基因Do-1357,编码钙依赖蛋白激酶（CDPK）的基因Do-1361,编码钙结合跨膜蛋白的基因Do-1229和编码细胞壁降解酶类的基因Do-1823（编码β-1,3-葡聚糖酶）、Do-830（编码几丁质酶）等在种子接菌共生萌发过程中特异表达，表明铁皮石斛种子接菌共生萌发可能涉及Ca2+信号途径的基因表达调控，并暗示宿主植物可能通过分解真菌细胞壁，以摄取营养物质推动萌发。除此之外，赵明明等还利用cDNA末端快速克隆技术（RACE），首次从铁皮石斛共生萌发种子中分离得到2个CDPKs基因（DoCDPK1、DoCDPK 32-like）和1个新的编码S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）基因（DoSAMDC 1），这3个基因在铁皮石斛种子共生萌发时均上调表达，分别是未萌发时的6.76倍、26.69倍和2.74倍，SAMDC是多胺合成关键酶，通过调节多胺的代谢参与植物的多项生理生化过程，这三者均具有受真菌侵染诱导表达的特性，揭示其可能通过参与Ca2+信号途径、多胺调控途径在真菌促铁皮石斛种子萌发方面发挥作用[57-58].
长久以来，一直有学者针对兰科植物种子接菌共生萌发过程中，它们二者是互利共生关系还是敌对关系这一问题进行争论。最近Perotto等通过454焦磷酸 测 序 得 到 了Serapias vomeracea与Tulasnellacalospora共生萌发至原球茎后的基因表达情况，研究发现，相比较于敌对关系相关基因（发病机制或伤口、压力 相 关），更 多 的 是 一 些 互 利 共 生 相 关 基 因 如nodulin-like基因在共生原球茎中得到了显着上调表达，其中有一个nodulin-like基因SvNod1与ENOD55基因相似（ENOD 55编码的蛋白中含有类似于质体蓝素结构域的结构），还有一个nodulin-like基因SvNod 9与糖转运子SWEET家族基因相似。
Perotto的研究表明，它们二者的关系更多的是互利共生而不是敌对的[59].Valadares等利用iTRAQ标记联合2D-LC-MS/MS分析鉴定并定量了Oncidium sphacelatum种子与真菌Ceratobasidiumsp.共生萌发时原球茎不同发育阶段的88个蛋白质分子，其中涉及到了能量代谢、细胞自愈与防御、分子信号和次生代谢[60].蛋白质的定量分析证实了绿色原球茎中碳代谢改变的预期，而这种改变是随着相关蛋白质的累加而实现的。兰科植物种子共生萌发分子机制的研究目前国内外刚刚起步，候选基因和蛋白的功能分析及验证还有待进一步研究。
5 结论与展望
回顾国内外近40年的有关兰科植物种子萌发的研究，在非共生萌发和共生萌发两大方面还存在诸多问题值得深入研究。
对于兰科植物种子非共生萌发，研究者要解决的问题是如何使种子高效萌发，围绕着这一目标，需要探究的是种子萌发过程中需要哪些营养物质、何种培养条件，不同属种、生境的兰科植物种子萌发的需求异同点，并从中找寻规律，为其它兰科植物种子萌发提供指导依据。具体而言，无非围绕着培养条件的优化：基本培养基的改良（碳源、氮源及其用量），激素的添加与否及浓度配比、天然提取物的添加与否及浓度配比，温度，光照；围绕着种子预处理：物理、化学方法及作用机制；围绕着种子萌发过程中发生的生理生化、形态变化、细胞结构变化、关键酶含量变化这些关键点展开研究。
对于兰科植物种子共生萌发，研究者要解决的问题是促进种子萌发真菌的分离鉴定，模拟自然条件的培养方式等，围绕着这一目标，需要探究的是促种子萌发真菌与兰科植物的对应关系，两者间的营养传递过程、互作机制等，理清了理论层面上的疑点，才能更好的指导实际生产。具体而言，通常围绕着促种子萌发真菌：如何分离鉴定，不同属种、生境的兰科促种子萌发真菌间的异同及各自的优势菌种，专一性问题；围绕着兰科植物种子：授粉方式对种子生长发育的影响，种子成熟度、预处理（破碎种皮，预孵化、低温层积等后熟作用）对萌发率的影响；围绕着二者共生萌发的条件（温度、光照、培养方式等），共生萌发过程中种子宏观形态变化，原球茎生长发育变化，真菌侵染时二者的细胞超微结构，共生萌发过程中某一组织、细胞器或细胞器结构（如微管）的变化，关键酶含量变化，共生萌发机制（碳源、氮源等营养角度，分子层面）。
每个时代的研究热点都离不开当下技术手段的发展，分子生物学的发展能以更微观更深层次的角度揭示事物的本质，同时根据其探究到的发展演变规律预测事物的发展走向。相比较模式植物水稻和拟南芥，兰科植物种子萌发分子机制研究并不多，因为其细小如尘埃，又具有复杂的“种子-真菌”共生系统，但随着研究手段的不断提高，兰科植物种子萌发相关研究会朝着更加微观的分子水平发展，兰科植物种子萌发机制尤其是共生萌发机制将得到进一步的阐释，这将为濒危兰科植物资源的可持续利用作出贡献。
参考文献：
[1]郑晓君，叶静，管常东，等.兰科植物种子萌发研究进展[J].北方园艺，2010（19）:206-209. [2]郭顺星，徐锦堂.兰科植物种子无菌萌发的研究[J].种子，1990,9（5）:36-37.
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