时间：2015-12-21 00:49:38 所属分类：园艺 浏览量:
中国苹果加工业发展迅速，但是原料匮乏，加工利用品种混杂严重，质量差等问题是产业发展的障碍。因此从现有的苹果资源中筛选适宜加工的品种，构建适宜加工苹果品种指纹图谱，了解其遗传关系，将有助于推动中国苹果加工品种的生产推广进程，加速育种利用和种
中国苹果加工业发展迅速，但是原料匮乏，加工利用品种混杂严重，质量差等问题是产业发展的障碍。因此从现有的苹果资源中筛选适宜加工的品种，构建适宜加工苹果品种指纹图谱，了解其遗传关系，将有助于推动中国苹果加工品种的生产推广进程，加速育种利用和种质创新。适宜加工用的苹果品种介绍已经有较多的报道（王昆 等，2007；王冬梅 等，2010）。刘金豹（2004）利用10 个从国外引进的加工专用苹果品种，研究了果实中与加工品质有关的指标及在果实发育进程中的变化特征。宋烨等（2006a，2006b，2006c，2007，2008）对从法国引入的 16 个适宜制汁和酿酒的苹果品种进行了遗传多样性和生物学特征研究，分析了主要品种果实糖代谢积累规律和酚类物质的组成及特性。聂继云等（2006）选择 8 项果实性状指标（可溶性糖、可滴定酸、维生素 C、香气、风味、果肉质地、汁液和异味）组成制汁用苹果品质评价体系。
TP-M13-SSR（即 simple sequence repeat with tailed primer M13）分子标记技术是 SSR 扩增产物检测过程中的一种基于荧光测序技术的高通量低成本分析技术体系。Oetting（1995）首次将一段 19bp 的核苷酸序列（称为 Tailed primer，即尾巴引物）引入到短串联重复（short tandem repeat，STR）标记体系中，并与荧光分析技术和多重 PCR（Multiplex PCR）技术相结合。Schuelke（2000）又用M13 序列作为尾巴引物和通用引物对该技术体系进行了完善，最终实现了 SSR 技术与荧光自动测序技术的完美整合，形成了一套低成本的基于荧光测序技术的 SSR 扩增产物检测体系，即 TP-M13-SSR技术。它需要一个具有普适性的用荧光标记的 M13 引物，并把 M13 的正向引物和一个 SSR 反向引物相连（称为 TP-M13 引物），利用 3 条引物序列进行 PCR 扩增，其 PCR 产物在 DNA 测序仪上进行自动荧光检测，其在较大程度上解决了分析通量较低、扩增产物检测流程繁琐、数据记录的工作量过大等一系列问题。此方法已被应用到玉米、高粱等作物的遗传多样性、基因型鉴定等研究中（李会勇 等，2005；刘志斋 等，2007），高源等（2010，2011a，2011b，2012）也将其应用到了苹果和梨种质资源的鉴定和遗传多样性研究中。
中国农业科学院农产品加工研究所和中国农业科学院果树研究所分别利用建立的苹果脆片品质评价体系和制汁用苹果品质评价体系在“国家果树种质兴城梨、苹果圃”中筛选出了 44 个适宜制汁和加工脆片的苹果资源。
本研究中利用TP-M13-SSR分子标记的方法构建已经筛选出的44个适宜加工苹果品种的指纹图谱，并对其进行遗传关系分析，旨在探明适宜加工用苹果品种的遗传谱系和亲缘关系，研究适宜加工苹果品种的加工特性和品质评价体系与遗传关系的相关性，为完善苹果加工品种的品质评价体系和培育加工品种提供参考。
1、 材料与方法
1.1 试验材料
在国家果树种质兴城苹果圃随机选取 190 个苹果品种的果实，分别在中国农业科学院果树研究所和农产品加工研究所按照苹果脆片品质评价体系和制汁用苹果品质评价体系进行适宜性评价，筛选出 25 个适宜制汁和 19 个适宜加工脆片的品种，取其叶片用于构建指纹图谱和遗传关系分析。
1.2 基因组 DNA 的提取与引物合成
2011 年春季，采用德国 QIAGEN 的 DNeasy Plant Mini Kit 提取供试材料叶片的基因组 DNA。
在 TP-M13 自动荧光检测系统中，用 3 条引物进行 PCR 扩增。第 1 条引物是把普通的 SSR 引物的正向引物分别和 M13 的正向引物相连合成带有 M13 尾巴的引物，即 TP-M13 引物；第 2 条引物为正常的 SSR 反向引物；第 3 条引物是 5′端带有荧光标记的 M13 正向引物。本试验中筛选出的11 对普通 SSR 引物均来源于报道的序列（Liebhard et al.，2002；Yamamoto et al.，2002a，2002b），TP-M13-SSR 引物（表 2）由上海 Sangon 公司合成；5′端带有荧光标记的 M13 正向引物（表 3）由美国 ABI 公司合成。
1.3 实验程序与数据分析
具体实验步骤和操作程序参照 Schuelke（2000）提供的巢式 PCR 和高源等（2010）对其优化后的程序和步骤。待电泳结束后，对样品的原始数据用 GeneMapper3.0 软件进行分析，获得不同样品扩增片段的长度；利用 NTSYSpc-2.10e 软件中的 Dice 方法计算各品种之间的相似系数，采用 UPGMA 法进行聚类分析，绘制树状图；再利用 PopGen32 对供试材料进行分析。
2、 结果与分析
2.1 筛选引物扩增的条件优化及 SSR 多态性
筛选的 11 对 TP-M13-SSR 引物优化后退火温度见表 4。用 11 对 SSR 引物对 44 个苹果适宜加工品种进行扩增，共获得 134 个等位基因。不同引物扩增的等位基因数差异较大，为 4 ~ 24 个，平均每个位点 12.2 个等位基因；观测杂合度（Ho）在 0.068 ~ 0.977 之间，平均值为 0.752；预期杂合度值（He）在 0.111 ~ 0.939 之间，平均值为 0.764（表 4）。
苹果引物 CH04h02 多态性最高，获得 24 个等位基因，位点杂合度也较高；梨引物 BGT23b多态性最低，获得 4 个等位基因，位点杂合度也较低。引物 CH04h02 扩增片段大小范围最大，为 155 ~ 281 bp，BGT23b 扩增片段大小范围最小，为191 ~ 199 bp。CH04h02 扩增‘瑞光’（27）获得的两个等位基因的重复序列差异最大，分别为 155和 281 bp，差别为 126 个碱基。
此次筛选的 SSR 引物多态性较好，杂合度较高，适宜构建适宜加工苹果品种 SSR 指纹图谱；梨引物 BGT23b 虽然多态性相对较差，但是仍然可以作为指纹图谱构建的补充 SSR 引物。
2.2 指纹图谱构建与品种鉴定
利用筛选出的 11 对 TP-M13-SSR 引物对 44 个适宜加工苹果品种进行扩增，准确获得不同材料在不同位点的等位基因的片段大小及相应的毛细管电泳图（图 1）。例如：特早红（1）在 SSR 位点 CH01f03b 的扩增片段大小为 163 bp 和 189 bp。每对引物的扩增带型数为 4 ~ 35 个，平均为 21.5 个（表 4）。仅利用两对引物 CH04h02 和 CH05d04 即可区分所有供试适宜加工苹果品种。
具有相同亲本的供试品种获得的指纹图谱差异较大，例如秋香（20）、红月（39）和乔纳金（32）的亲本均为金冠 × 红玉，秋香和红月仅在位点 BGT23b 处指纹图谱相同，而红月和乔纳金仅在位点 CH02b121、CH04g07 和 BGT23b 处指纹图谱相同。44 个适宜加工苹果品种的 TP-M13-SSR 指纹图谱互不相同，可以作为各品种特定的图谱，在直接推广应用时，为品种鉴别提供重要依据。
2.3 遗传多样性分析
44 个品种 11 个 SSR 位点的香农指数的变化范围分别为 0.278 ~ 2.881，平均值为 1.940。不同位点的等位基因频率的变化差异较大，CH04h02 在 44 个品种中扩增出 24 个等位基因，有 7 个等位基因的频率仅为 1.14%（表 6），等位基因频率最高的也仅为 17.05%；而 BGT23b 扩增出 4 个等位基因，等位基因频率最高的达 94.32%，但是每个位点均有频率较低的等位基因出现。说明此次筛选出的适宜加工的苹果品种遗传基础广泛，基因杂合度高，有益于育种利用。
根据 44 个适宜加工苹果品种在 11 个 SSR 位点的指纹图谱数据，得出两两品种间的 Dice 相似系数。44 个品种的相似系数在 0.7259 ~ 0.9704 之间，其中以特早红和秋映之间相似系数最低为0.7259，紫香蕉和丹顶之间相似系数最高，为 0.9704。适宜制汁的与适宜加工脆片的品种间的相似系数小于适宜制汁品种间或适宜加工脆片的品种间的相似系数，说明供试品种间遗传差异大小不同，适宜制汁的品种间亲缘关系较近，适宜加工脆片的品种间亲缘关系也较近，而适宜制汁的与适宜加工脆片的品种间亲缘关系较远。
以相似系数进行聚类，在相似系数 0.798 处划分供试品种（图 2）。适宜制汁苹果品种归类明显，除瑞光、马空、红月、蜜脆、珍宝、赤阳和短枝金冠，其余 18 个适宜制汁的苹果品种均聚到了一起。
在相似系数 0.859 处，秋香（金冠 × 红玉）、友谊（红玉自然实生）、乔纳红（红玉芽变）、红玉和甜红玉（红玉芽变）紧密聚到一起，它们均具有相同的亲本红玉；在相似系数 0.831 处，绿帅（金冠实生）、金冠、乔纳金（金冠 × 红玉）紧密聚到一起，它们具有相同的亲本金冠；在相似系数 0.845处，恋姬（拉里坦 × 富士）、富士和寒富（东光×富士）紧密聚到一起，他们具有相同的亲本富士；另外，富士（国光 × 元帅）、寒富[东光 × 富士（国光 × 元帅）]、惠（国光 × 红玉）、华红[金冠 × 惠（国光 × 红玉）]、千秋[东光 × 富士（国光 × 元帅）]和华富[富士（国光 × 元帅）花药培养]均较近地聚到了一起，而它们系谱里均具有相同的亲本国光。适宜加工脆片的苹果品种聚类相互交错，比较分散，甜黄魁、红之舞、芳明、友谊、阳光、红玉和富士 7 个适宜加工脆片的苹果品种被聚在了适宜制汁的苹果类群中，并与秋香、乔纳红、红玉、甜红玉、绿帅、金冠、乔纳金等适宜制汁的苹果品种聚在一起。说明适宜制汁的加工特性与遗传关系的相关性要高于加工脆片的加工特性与遗传关系的相关性。
3、 讨论
3.1 适宜加工苹果品种的 SSR 指纹图谱
本研究中将 SSR 分子标记技术和荧光标记技术相结合，建立 TP-M13-SSR 分子标记技术体系，准确获得适宜加工苹果品种在 11 个 SSR 位点的指纹图谱，重复性好。44 个品种的 TP-M13-SSR 指纹图谱可以作为各品种特定的图谱，作为品种鉴别重要依据，防止生产推广过程中同名异物和同物异名的产生。SSR 标记属于共显性遗传，子代获得的等位基因与亲本相关。本研究中，包含了较多以金冠或（和）红玉作为亲本的苹果品种，但是其在 11 个位点获得等位基因与亲本金冠或（和）红玉获得的等位基因偶有不符合 SSR 共显性遗传规律的情况，可能是供试子代苹果品种本身发生的变异。SSR 难以区分芽变品种，但在本研究中，乔纳红为红玉芽变品种，利用 SSR 引物 CH04h02、CH05d04 和 CH01f07a 均可以把两者区分开；斯塔克金矮生为金冠的芽变品种，除 SSR 引物 CH02b121和 CH04g07 其余 9 个 SSR 位点均可以把两者区分开，说明芽变区域包含了可以将品种区分开的 SSR位点，证明了利用 SSR 不能区分芽变品种是与检测的 SSR 位点数不足有关。
3.2 适宜加工苹果品种的加工特性与其遗传背景
供试的适宜制汁的苹果品种大多数与金冠、红玉或富士有亲缘关系，在聚类分析中，与不同亲本相关的品种分别聚成几个类群，说明了适宜制汁苹果品种遗传背景比较相似，或是存在相似的品质性状控制基因及其 SSR 连锁标记。而适宜加工脆片的苹果品种亲本较杂，因此聚类也比较分散。
也可能是控制制脆片性状的基因相对较少，其在遗传背景总体中的分量较轻，因而不能在树状图中凸显出来。由此推测，制汁品质可能偏向于多基因控制的数量性状控制，而加工脆片的特性可能偏向于寡基因控制的数量性状控制。
3.3 适宜加工苹果品种的品质评价体系的建立
聂继云等（2006）对制汁用苹果品质评价体系进行了探讨，确定由 8 项指标组成。王沛等（2012a，2012b）测定了 15 个中早熟苹果品种脆片的 16 项品质指标，并基于 16 项指标对 15 个品种的适宜加工脆片特性进行评价；之后又对 16 项品质评价指标进行相关性分析。由于基因之间连锁等方面的原因，各个品质评价指标之间存在着不同程度的相关性。但是，目前由于加工工艺以及人的感官差别等因素，国内外研究者还未建立一个系统、全面且标准统一的苹果脆片品质评价体系，同时也缺少仪器测定值与感官评价相关性研究（王沛 等，2010）。适宜加工脆片的品种与适宜制汁的品种的评价标准有差异，同时又有相重合的评价指标。适宜制汁和适宜加工脆片的品种虽各自聚成不同的类群，体现了不同的遗传关系，但相似系数相对较高。苹果加工品种的加工特性受遗传关系影响。因此在不断完善其品质评价体系的同时需要兼顾遗传关系与加工特性的相关性。
3.4 适宜加工苹果品种育种亲本的选择
此次筛选出的适宜加工的苹果品种的亲本多为金冠、红玉、国光、富士和元帅，其中以金冠为亲本的最多，以红玉为亲本的次之，含有国光血缘的再次之。这些品种可以作为加工品种的育种亲本，加强利用。
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