时间：2019-03-01 10:47:20 所属分类：植物保护 浏览量:
摘要：采用组织分离法从健康的山牵牛[Thunbergia grandiflora (Rottl. ex Willd.) Roxb.]叶片中分离到6株内生细菌;通过平板对峙试验，筛选出对山牵牛叶斑病病原菌及其他9种植物病原真菌均具有较强作用的2个菌株(bjq-a、bjq-d)，其中内生细菌bjq-a的抑菌带宽
摘要：采用组织分离法从健康的山牵牛[Thunbergia grandiflora (Rottl. ex Willd.) Roxb.]叶片中分离到6株内生细菌;通过平板对峙试验，筛选出对山牵牛叶斑病病原菌及其他9种植物病原真菌均具有较强作用的2个菌株(bjq-a、bjq-d)，其中内生细菌bjq-a的抑菌带宽度最大;通过形态鉴定并结合16S rDNA序列测定，对bjq-a、bjq-d菌株进行鉴定，分别为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);通过显微观察，bjq-a、bjq-d菌株均可造成山牵牛炭疽病病原菌菌丝膨大、畸形、断裂。
关键词：山牵牛[Thunbergia grandiflora (Rottl. ex Willd.) Roxb.];叶斑病;拮抗细菌;筛选;鉴定
山牵牛[Thunbergia grandiflora(Rottl. ex Willd.)Roxb.]，别名大花山牵牛、大花老鸦嘴、大青和老鸦杓，是爵床科(Acnthaceae)山牵牛属藤本植物[1]。山牵牛在广西、广东、海南和福建鼓浪屿等地均有种植。山牵牛是瑶医药用植物之一，主要用于消肿拔毒，排脓生肌，止痛;根皮用于跌打损伤和骨折;茎叶用于蛇咬伤，疮疖，叶用于治疗胃痛[2，3]。目前，山牵牛主要作为观赏藤本植物[4]，对其药理活性和病害研究尚未见报道。2017年在广西南宁市广西药用植物园瑶药区调查发现一种严重影响山牵牛生长的病害，该病害主要为害山牵牛叶片，严重时造成叶片枯死，该病害已初步鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。
以化学药剂防治山牵牛叶斑病，容易引起病害复发，导致病原菌产生抗药性和耐药性，以及农药残留等问题。利用生防菌防治植物病害，具有对环境安全的优点，已经成为防治植物病害的重要方法之一，是目前国内外研究热点，也是将来绿色农作物和绿色中药材发展的必然趋势。应用拮抗微生物防治山牵牛叶斑病在国内外鲜见报道，本研究拟从山牵牛健康植株的叶片组织中分离筛选出有效控制此病害的生防细菌，以期为山牵牛叶斑病的生物防治提供依据和参考。
1 材料与方法
1.1 材料
山牵牛于2017年5月采自广西壮族自治区药用植物园瑶药区种植地，采集其健康叶片放入保鲜袋中，密封，编号。山牵牛致病菌炭疽菌是广西药用植物园病理实验室保存，菌株号为sb10。
培养基有营养琼脂(Nutrient agar，NA)、牛肉膏蛋白胨培养基(Nutrient broth，NB);马铃薯葡萄糖培养基(Potato dextrose agar，PDA)。
1.2 菌株的分离、纯化
采用组织分离法，即将健康山牵牛的根、茎、叶片用 75%乙醇、无菌水擦拭干净，晾干，加入10 mL无菌水和少量石英砂研磨成匀浆制成10-1原液，用移液枪吸取1 mL上层液体至装有9 mL无菌水的试管中，振荡均匀得到10-2稀释液。按此方法再将液体稀释至10-3、10-4、10-5、10-6备用。分别吸取不同浓度的液体0.1 mL均匀涂布到NA培养基上，每处理重复3次。将涂布好的平板放入恒温培养箱，28 ℃培养48 h。根据菌落形态、顏色、透明度、边缘整齐度、干湿等特征，挑取不同性状的细菌菌落在NA平板上划线纯化、编号。将纯化好的细菌在4 ℃冰箱保存备用。
1.3 山牵牛炭疽菌拮抗细菌的筛选
将供试病原真菌接种到PDA平皿离边缘1.5 cm处，距菌种块3 cm处划线接种同一株内生细菌，每个处理3次重复。28 ℃培养7 d后测量抑菌宽度。
1.4 菌株的鉴定
1.4.1 形态鉴定 观察菌落的形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度;革兰氏染色观察菌体形态。
1.4.2 菌株的16S rDNA分析 将培养3 d的拮抗菌株接种到40 mL NB培养液三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r/min，恒温振荡培养48 h后制成菌体悬浮液，离心收集菌体，采用改良的SDS裂解法用DNA提取试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取细菌基因组DNA。采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对提取的DNA进行PCR扩增(上海生工生物工程技术服务有限公司)。扩增反应在25 μL反应体系中进行，Template(基因组DNA 20～50 ng/μL)为0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)为2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol)为1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加无菌水至25 μL。热循环反应程序设置如下：94 ℃初始变性4 min，94 ℃变性 45 s，55 ℃引物退火45 s，72 ℃延伸60 s，30个循环，72 ℃修复延伸10 min。
扩增中利用无菌水代替DNA模板作为空白对照。用凝胶电泳法检测PCR反应结果，吸取4 μL PCR产物加入1%(W/V，W、V分别代表琼脂糖质量和缓冲液的体积)琼脂糖凝胶，凝胶置于1×TBE缓冲液(0.9 mol Tris-Borate，0.01 mol EDTA，pH=8.3)中，110 V电泳40 min。将扩增后的DNA产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化测序。并且把测序结果与GenBank中的序列进行Blast比对。以16S rDNA相似序列，利用MEGA 4.0软件的Neighbor-Joining法构建系统发育树。
1.5 抑菌谱的测定
测定筛选出的菌株对供试菌三七根腐病(Fusaium solani)、香蕉煤纹病(Helminthosporium torulosum)、苦玄参叶斑病(Alternaria sp.)、香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum)、三七黑斑病(Alternaria panax)、广西莪术叶斑病(Phomopsis sp.)、烟草灰霉病(Botrytis cinerea)、三七炭疽病(Colltetorrichum gloeosporioides)、艾纳香褐斑病(Phoma sp.)的抑菌活性，以注入无菌水为对照。
1.6 抑菌活性测定
对内生菌抑菌活性的初筛、复筛采用对峙法[6]。初筛出优良菌株进行复筛，过程如初筛，每个处理3次重复。
1.7 病原菌菌丝显微镜观察
把菌落直接放置于倒置显微镜的载物台上，观察处理菌株和对照菌株菌丝体的形态变化，记录并拍照。
2 结果与分析
2.1 拮抗细菌的分离与筛选
从广西药用植物园瑶药区种植山牵牛叶片分离到6株细菌。以山牵牛炭疽菌为指示菌，筛选出有抑菌作用的拮抗菌2株，分别是bjq-a、bjq-d，其抑菌宽度见表1。从表1可以看出，抑菌宽度最大的是bjq-a，达到24.25 mm。
在PDA平板对峙法中，接种bjq-a、bjq-d菌株后，拮抗菌对山牵牛炭疽菌sb10具有明显的抑菌带，病原菌菌丝生长受到较明显抑制，并且在病原菌菌落的边缘与抑菌带接触部位的菌丝发生溶解，整个菌落的生長受到明显抑制(图1)。
2.2 山牵牛叶斑病病菌菌丝的被抑制作用
在拮抗培养中，内生细菌和病原菌的菌落从未接触，而病原菌靠近内生菌的菌落边缘部分有萎缩现象，镜检结果显示，正常生长的植物病原菌菌丝粗细均匀、粗壮、光滑，生长菌丝舒展(图2a)。挑取拮抗菌和病原菌对峙培养相交处菌丝于光学显微镜下观察，发现经拮抗菌处理后，山牵牛的病原菌菌丝膨大、畸形、断裂(图2b、图2c)。
2.3 拮抗细菌的抗菌谱
由表2可知，2个拮抗菌株对9种病原真菌，即三七根腐病、香蕉煤纹病、苦玄参叶斑病、香蕉枯萎病、三七黑斑病、广西莪术叶斑病、烟草灰霉病、三七炭疽病、艾纳香褐斑病均有抑制作用。其中，拮抗菌bjq-a对三七黑斑病、广西莪术叶斑病抑菌宽度分别达到25.00和27.50 mm;bjq-d对苦玄参叶斑病、艾纳香褐斑病、烟草灰霉病抑菌宽度分别达到20.00、20.00、22.75 mm。初步说明这2种拮抗菌株对植物病原真菌具有一定的广谱性，有生防作用前景。
2.4 拮抗菌株的鉴定
2.4.1 形态特征 2个拮抗菌株在NA培养基上呈乳白色菌落，圆形或近圆形，表面湿润不透明，边缘无波状，无褶皱。菌体呈杆状，革兰氏染色呈阳性。
2.4.2 分子生物学鉴定 以bjq-a、bjq-d 2个菌株基因组DNA为模板，用通用引物27F和1492R对16S rDNA序列进行PCR扩增，将获得的扩增产物进行测序，得到核苷酸序列大小分别为1 443、1 451 bp。将该序列通过Blast程序与GenBank中序列进行对比分析。结果显示，2个菌株与其比对的芽孢杆菌属同源，相似度高达99%，采用MEGA 4.0软件以GenBank中16S rDNA相似序列及其2个菌株16S rDNA序列构建系统进化树。结果(图3)表明，菌株bjq-d与GenBank登录号JX290193菌株的亲缘关系最近，此菌株与解淀粉酶芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)综合菌株的形态学特征及分子生物学鉴定，可初步鉴定为解淀粉酶芽孢杆菌;而bjq-a菌株与GenBank登录号KF359964菌株的亲缘关系最近，综合菌株的形态学特征及分子生物学鉴定，可初步鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。
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