时间：2015-12-20 17:11:01 所属分类：基础医学 浏览量:
功能性慢性内脏痛是一组以腹痛或腹部不适同时伴有排便习惯及大便性状改变为主要特征的肠道功能性疾病，内脏高敏是其重要的病理生理学基础，但目前其分子生物学机制尚不清楚。长期以来，传统的观点认为疼痛在脊髓水平的调制和整合只与神经元有关，神经胶质细
功能性慢性内脏痛是一组以腹痛或腹部不适同时伴有排便习惯及大便性状改变为主要特征的肠道功能性疾病，内脏高敏是其重要的病理生理学基础，但目前其分子生物学机制尚不清楚。长期以来，传统的观点认为疼痛在脊髓水平的调制和整合只与神经元有关，神经胶质细胞仅对神经元起支持和营养作用。然而，最近的文献报道，慢性疼痛时神经胶质细胞激活并且对疼痛的整合和传导起重要的作用。研究表明，脊髓小胶质细胞在功能性慢性内脏痛的启动发挥重要作用，而对内脏痛的维持作用尚未研究。本研究通过对新生期大鼠给予结直肠扩张观察脊髓小胶质细胞是否参与大鼠幼年、青年到成年内脏高敏的维持过程。
方 法
1. 实验动物及动物分组新生第 8 天雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠，由徐州医学院实验动物中心提供。新生大鼠与母鼠同笼直到 28 天，鼠乳喂养。母婴分离后，每 4 只子鼠一笼，保持室温（23±1）℃及 12 h/12 h 明 /暗光照，能够自由取食和进水。随后大鼠正常饲养到第 6（幼年）、8（青年）、12（成年）周进行下述各项实验。采用随机数字表法，将大鼠随机分为2 组（n = 15）：假手术组（S 组）、新生期结直肠扩张组（CRD 组）。
2. 试剂和仪器羊抗大鼠 Iba-1（Abcam 公司，美国），Alexa594 驴抗羊 IgG (Life Technologies 公司，美国 )，BL-420E + 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司，中国），荧光显微镜（Olympus IX-81，日本）。
3. 功能性慢性内脏痛模型建立参照文献通过新生期反复结直肠扩张（colore-ctal distension, CRD）的方法制备功能性慢性内脏痛模型：新生大鼠于出生后第 8、10、12 天，每天上午固定时间给予两次结直肠扩张，两次时间间隔30 min。结直肠扩张是将直径 3 mm，长 20 mm 的血管成形术导管从肛门插入至清醒新生大鼠的降结肠，用 0.3 ml 水扩张产生 60 mm Hg 的压力在结肠内留置一分钟后，将其减压退出。S 组大鼠除未进行结直肠扩张外，其他操作均与 CRD 组一致。
4. 行为学检测（1）腹壁撤退反射（abdominal withdrawal re?ex,AWR）评分及痛阈：两组大鼠在出生后第 6、8、12 周进行行为学检测。按 Lin, C等报道的方法，大鼠在实验前 18 h 禁食不禁水，用乙醚或氟烷麻醉后，将未充气的球囊涂石蜡油后插入结直肠内，将大鼠放置在 20 cm×6 cm×8 cm 的有机玻璃箱内观察，约 30 min 大鼠完全适应后开始实验。分别采用20、40、60、80 mmHg 四个压力，每次扩张持续20 s，刺激间隔 4 min，取 3 次评分之均值。为了能客观比较 S 组和 CRD 组大鼠的各项指标，检测时采用单盲法，即对实验操作者隐瞒实验动物的类型。
AWR 的评分标准为：0 分：无明显行为变化；1 分：大鼠身体不动或仅有简单的头部运动；2 分：腹部肌肉开始收缩；3 分：下腹壁抬离箱底或明显收缩变平；4 分：腹壁拱起或伴身体、骨盆躬起。
AWR 方法测定痛反应阈：球囊放置等过程同前，通过注射器持续、缓慢加压，每 10 mmHg 为一压力梯度，每个压力停留 10 s，间隔 4 min，以肉眼观察出现明显的下腹壁抬离箱底或明显收缩变平（AWR=3 分）时的最小压力值为痛阈。扩张压力范围在 10 mmHg ～ 80 mmHg 之间；每只大鼠重复三次，取平均值。
（2）腹外斜肌放电的测量前述方法置入球囊后，将大鼠固定于手术台上，用 1% 左右的氟烷维持麻醉，并随时通过测量疼痛反应调整气体麻醉机内氟烷的流量，使大鼠不发生自主活动，却有疼痛反应存在。将银丝双极电极插入腹股沟韧带上方、距中线 1.5 cm 的一侧腹外斜肌上，待适应 15 min 后，对清醒大鼠予以结直肠扩张，压力梯度分别为 20、40、60、80 mmHg，每次加压 10 s，刺激间隔 4 min。用 BL-420E + 生物机能实验系统记录在不同压力的结直肠扩张刺激下大鼠腹外斜肌的放电活动变化。记录参数设置：
高频滤过 2 KHz，时间常数 0.001 s，采样频率为40 Hz，灵敏度 500 ?v，扫描速度 250 ms/div。实验环境要求安静，保持相对湿度在 40％～ 70％，室温 23℃～ 27℃范围之内。
5. HE 染色及免疫荧光
两组大鼠于出生后第 6、8、12 周行为学测定结束后 , 每组随机取 4 只在 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉下，迅速开胸暴露心脏经升主动脉插管，依次灌注 4℃生理盐水 200 ml 及 4％多聚甲醛 300 ml，取距肛门 10 cm 处肠段置于 4％多聚甲醛后固定6 h，移至 30％蔗糖脱水至组织沉底，常规石腊切片，HE 染色，光镜观察肠粘膜形态，切片由徐州医学院病理科专家诊断，观察指标为结直肠局部组织有无损伤和炎症等异常改变。
同时取脊髓 L2～ S4节段后固定，沉糖。用恒冷冰冻切片机切片（厚度 30 ?m），于 L2～ S4脊髓节段每隔 4 片取 1 片，PBS 漂洗 5 min×3 次，用含有 0.3% Triton X-100 的 10% 驴血清室温封闭2 h，加入羊抗大鼠 Iba-1 抗体（1：200），4℃孵育 24 h，PBS 漂洗 5 min×3 次，暗室内加入 Alexa594 驴抗羊 IgG（1：200），室温孵育 2 h，PBS 漂洗 5 min×3 次，将切片贴于载玻片上，自然晾干后，90% 甘油封片，立即用荧光显微镜观察及拍片。
每个标本随机取 L2～ S4脊髓节段的 5 张切片，依Rexed 分层法将脊髓灰质分成 10 层，以大鼠脊髓背角Ⅰ - Ⅱ板层来计数活化的小胶质细胞，并计算小胶质细胞活化率（活化的小胶质细胞数 ÷ 小胶质细胞总数×100%）。静息状态小胶质细胞胞体较小，突起细长，荧光强度较弱；活化的小胶质细胞胞体增大，突起缩短增粗，荧光强度变深。
6．统计学方法
数据用均数 ± 标准差 (x±SD) 表示，采用SPSS 13.0 统计学软件进行数据分析，两组间比较采用成组t 检验，P < 0.05 表示差异有统计学意义。
结 果
1．HE 染色观察结直肠病理变化情况常规病理切片光镜下：两组大鼠不同时期结直肠组织结构完整，排列整齐，黏膜表面光滑，固有层内肠腺规则；胞质呈嗜酸性红染，胞核为圆形或椭圆形，染成均匀的蓝黑色，形态规则，大小较为一致，核仁清晰可见；周围间质无明显水肿，未见中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞浸润。
2．AWR 评分、痛阈及腹外斜肌放电的变化大鼠出生后第 6、8、12 周，与 S 组相比，CRD 组大鼠在 20、40、60、80 mmHg 结直肠压力下 AWR 评分及腹外斜肌放电幅度明显增加，痛阈明显降低（P < 0.05，见表 1 ～ 3）。
3．免疫荧光检测小胶质细胞的活化情况与 S 组比较，CRD 组大鼠在出生后第 6、8、12 周脊髓背角Ⅰ - Ⅱ板层小胶质活化数及活化率明显增加（P < 0.05，见表 4 和图 1）。
讨 论
新生早期是伤害性感觉神经回路发育的关键时期，此时的疼痛刺激可以导致新生个体神经传入通路永久性的改变。新生儿的神经系统以可塑性强为显着特征。最近临床观察发现，功能性慢性内脏痛的病人与健康人相比，多有童年不良生活经历。Lin C等报道，新生期结直肠扩张可以导致成年大鼠功能性慢性内脏痛。本研究结果显示新生期给予结直肠扩张的大鼠与对照组相比，在出生后第 6、8、12 周 AWR评分及腹外斜肌放电幅度明显增加，痛阈明显降低，且局部没有明显的结直肠病理改变，表明功能性慢性内脏痛模型制备成功，且从幼年一直维持到成年。
神经元的敏化被认为是导致慢性疼痛的主要原因。然而最近的文献报道：神经胶质细胞与痛信号的传导和调控关系密切，神经胶质细胞可分泌一系列细胞因子和生长因子，改变神经元周围的化学环境，影响神经元的兴奋性。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，起免疫监视、免疫防御及免疫调控的作用。研究已经证实，脊髓小胶质细胞与外周损伤导致的慢性疼痛的产生密切相关。以往研究表明，小胶质细胞活化参与慢性疼痛的启动，星形胶质细胞激活与慢性疼痛的维持密切相关。
在功能性慢性内脏痛中小胶质细胞发挥启动作用已被证实，本实验结果发现，大鼠出生后第 6、8、12 周，CRD 组脊髓小胶质细胞活化数及活化率与对照组比较明显增高，表明小胶质细胞活化参与功能性慢性内脏痛维持阶段，提示功能性慢性内脏痛与外周损伤导致的疼痛模型的疼痛持续状态的维持机制不同。其可能机制是：小胶质细胞活化后能分泌兴奋性氨基酸、白介素 -1β、白介素 -6、肿瘤坏死因子 -α 和前列腺素 E2，这些介质可以使神经元兴奋性增高，产生中枢敏化；中枢敏化后神经元又会产生大量的 ATP、P 物质、谷氨酸等，继续激活小胶质细胞，构成一个小胶质细胞激活和中枢敏化相互作用的回路。进一步的研究将应用小胶质细胞特异抑制剂米诺环素进行干预，以明确小胶质细胞与功能性慢性内脏痛的相关性。
综上所述：脊髓小胶质细胞活化参与新生期结直肠扩张大鼠由幼年到成年内脏高敏的维持过程。【图表略】
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