时间：2015-12-20 17:11:51 所属分类：基础医学 浏览量:
含有骨质的肿瘤，钙化组织及骨髓穿刺组织都很坚硬，要想制成几微米的漂亮 HE 切片是很困难的。脱钙液是决定骨骼、牙齿、病理性钙化或骨化组织切片质量、染色效果的关键技术之一。目前使用的脱钙液大多数是无机强酸类制剂，虽然脱钙效果好，但造成组织形态，
含有骨质的肿瘤，钙化组织及骨髓穿刺组织都很坚硬，要想制成几微米的漂亮 HE 切片是很困难的。脱钙液是决定骨骼、牙齿、病理性钙化或骨化组织切片质量、染色效果的关键技术之一。目前使用的脱钙液大多数是无机强酸类制剂，虽然脱钙效果好，但造成组织形态，特别是细胞结构的破坏。因此，在本实验中我们选择了传统的脱钙液和快速脱钙液两种脱钙液进行比较，进而寻找一种更适合于骨组织脱钙的方法。研究中发现快速脱钙液在不破坏组织结构及影响染色的同时，它可促进脱钙并加快脱钙速度，防止纤维性组织过度膨胀，并且保证了切片的质量，现报道如下。
1 材料与方法
1． 1 材料
收集内蒙古医科大学附属医院 2009 － 2011 年手术切除的骨肿瘤、病变骨及骨髓穿刺病人标本共40 例。根据标本的不同将骨组织取成体积为 1． 5cm × 1． 5 cm × 0． 5 cm 的薄片( 骨髓一般直径均为0． 1 cm) ，放入 10% 中性福尔马林固定 24 h，用于脱钙实验。
1． 2 普通脱钙液及脱钙方法与步骤
普通脱钙液是 5%的硝酸，即 5 ml 硝酸加入 95ml 蒸馏水配制而成。具体脱钙步骤: ①先把大块骨组织标本切成小段，小块骨组织标本不用改刀，然后放入 10%中性福尔马林中固定 24 h 左右后再进行脱钙。②将待脱钙的标本放入 5% 硝酸脱钙液中，脱钙液不少于待脱钙标本总体积的 10 倍。③室温下进行脱钙: 骨髓穿刺标本需 30 － 60 min，肋骨、指趾骨需 3 －6 d，皮质骨需要 5 －7 d。④脱钙后的组织经流水冲洗后进行取材、脱水、透明、常规石蜡包埋、制片。
1． 3 快速脱钙液及脱钙方法与步骤 快速脱钙液是由 36% －38% 盐酸 8 ml、冰醋酸5 ml、水杨酸 10 g 、蒸馏水 87 ml 混合而成。用微波炉进行微波时，微波辐射可加速组织内部分子运动，加快脱钙速度，因标本在酸性溶液中滞留的时间短，所以对组织的损伤小。具体脱钙步骤: ①先把大块骨组织标本切成小段，小块骨组织标本不用改刀，然后放入装有快速脱钙液的耐高温塑料容器或玻璃容器内，容器要大并加盖，脱钙液不少于待脱钙标本总体积的 10 倍。②再将容器放入最大功率为 850 W的医用微波炉中进行微波脱钙。③入微波内加热高档( 850 W) 5 min 达 100 ℃，骨髓穿刺标本继续留置10 min，其他标本继续留置 30 min 为一个循环，检查脱钙效果。④脱钙后的标本无需水洗，直接进行病理取材、脱水、透明，常规石蜡包埋、制片。
1． 4 脱钙时间
室温下普通脱钙液及微波条件下快速脱钙液进行各种组织脱钙所需时间有所不同，具体见表 1。【表1】
2 结果
标本用快速脱钙液处理后的效果要远远优于普通硝酸脱钙，经此脱钙液防止了纤维性组织过度膨胀，减少对骨组织结构完整性的破坏，制成的组织切片厚度一般为 4 －5 μm，不易脱片，并且切片平坦完整，薄厚均匀，HE 染色新鲜，尤其细胞核染色清晰，着色鲜艳( 图 1A、1B，见第 1004 页) 。而普通脱钙液制成的组织切片，薄厚不均，切片不完整，HE 染色模糊，尤其是核着色不清，影响病理诊断( 图 1C、1D，见第 1004 页) 。
3 讨论
因骨组织、骨肿瘤含有大量的钙盐，钙盐只有遇酸溶解后组织变软才能制作切片。脱钙是应用化学或物理的方法将骨组织成分中的钙盐及胶原纤维分离，弃去钙盐保留完整的胶原纤维成分。
无论是任何一种脱钙方法都是为了清除骨组织钙盐而使骨组织变软进而进行制片。但是不同脱钙方法对骨组织制片影响不同，因此选择优质、方便、快捷的脱钙方法对骨组织方面疾病的病理诊断至关重要。
传统脱钙方法是将标本取好直接放入 5% 硝酸溶液中进行脱钙，一般需要 1 －10 d，然后再经固定脱水、包埋切片; 切片厚度约在 6 －7 μm 以上，并且切片时组织不完整，厚薄不均又易脱片，不仅损刀片，脱钙时间也不好掌握。因为酸在溶解钙盐的同时也溶解胶原纤维，虽然部分被溶解的钙盐与胶原纤维分离，但是还有部分钙盐与溶解的胶原混合存在，这样妨碍了钙盐与胶原纤维的彻底分离，阻滞了酸由表及里地溶解钙盐的作用。结果造成脱钙时间延长、脱钙不彻底或脱钙后的组织不完整、进而破坏组织细胞形态结果及细胞成分的性质。最终造成细胞核不着色或着色很浅，从而影响对病变组织的病理诊断。
而采 用 快 速 脱 钙 液 进 行 脱 钙 一 般 需 要10 － 40 min，不但将脱钙时间缩短，同时保证了制片质量。因为快速脱钙液中的水杨酸具有松懈作用，能加速酸性溶液由表及里地溶解钙盐，被溶解的钙盐迅速发生沉淀，减少了与溶解胶原的混合，充分发挥水杨酸松解胶原作用; 促进脂肪溶解，并且水杨酸还能破坏蛋白质的交联，疏通组织间隙，有利于钙盐析出快速脱钙。因组织在酸性溶液里滞留时间短，对组织损害小，这样切片较完整，染色效果极佳。此种脱钙方法简单、便捷、快速，是有效的骨组织脱钙方法，有利于保存骨组织结构和组织中的抗原物质，从而确保了临床病理诊断。
总之，我们认为快速脱钙液要比普通脱钙液在临床诊断上更为适用。此种脱钙液在不破坏组织结构及影响染色的同时，可促进脱钙并加快脱钙速度，防止纤维性组织过度膨胀，并且保证了良好的切片质量。
参考文献:
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