比较细胞表面黏附分子在牵张力引起的HL-60细胞黏附中的差异

时间：2015-12-20 17:14:26 所属分类：基础医学 浏览量: 139

近年来研究发现动脉粥样硬化和高血压的发生与血管炎症反应存在着紧密联系，动脉内膜出现脂质斑点、粥样或纤维样斑块等炎性病变，使血管壁增厚和血管内皮细胞受损造成血管硬化和血管阻力增高是高血压发生、发展的重要原因。许多炎症因子可以通过直接作用于血

　　近年来研究发现动脉粥样硬化和高血压的发生与血管炎症反应存在着紧密联系，动脉内膜出现脂质斑点、粥样或纤维样斑块等炎性病变，使血管壁增厚和血管内皮细胞受损造成血管硬化和血管阻力增高是高血压发生、发展的重要原因。许多炎症因子可以通过直接作用于血管内皮细胞，导致其功能紊乱和血管张力失调，从而参与高血压发生和发展的病理过程。内皮细胞内贮存着大量的生物活性物质，包含前炎症因子与前凝血因子，例如: P-选择素( P-selectin) 、E-选择素( E-selectin) 、细胞间黏附分子-1( intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1) 和血管细胞黏 附 分 子-1 ( vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1) 和血管假性血友病因子 ( von Willebrandfactor，vWF) 等，这些分子与细胞黏附、炎症、血栓形成及止血密切相关。有报道显示血压升高引起的牵张力长期作用于血管内皮细胞会引起炎症因子释放增加，多种细胞黏附分子表达水平升高，机械性牵张力通过改变内皮细胞表面血管黏附分子和栓塞分子的表达来调节炎症反应和血栓形成。我们前期研究发现 P-selectin 在机械性牵张力诱导的炎症细胞黏附过程中发挥十分重要的作用，它可以明显促进炎症细胞黏附，而 VCAM-1 在受血管牵张力刺激后在黏附过程中是否起作用以及 P-selectin 和 VCAM-1引起的炎症细胞黏附能力强弱的比较还未见报道。

　　1 材料和方法

　　1． 1 材 料　　　　HL-60 人白血病淋巴母细胞样细胞株来自于ATCC 细胞库，M199 培养基、胎牛血清购自 Gibco 公司，青霉素、链霉素和化学试剂购自 Sigma 公司; 小鼠抗 P-selectin 抗体、小鼠抗 VCAM-1 抗体和 IgG2a 同型对照抗体购自 BD 公司; S100 倒置相差显微镜、体视显微镜购自 Nikon 公司、国产玉兔牌血压计购自北京王府井医药器械公司、离体血管分析仪购自 Living systems 公司、XC-ST50CE 型摄像机及显示器购自 SONY 公司、注射泵购自 HAＲVAＲD 公司; 8 ～ 10 周C57BL /6J SPF 级小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

　　1． 2 方法　　　　本实验是建立在离体小鼠颈总动脉上的黏附模型。实验前用血压计校准压力感受器、校准血管直径测量标尺，并用生理盐水灌流血管分析仪液体循环管道并排空气泡。

　　1． 2． 1 不同牵张力刺激小鼠颈总动脉诱导 HL-60 细胞黏附实验 小鼠左右颈总动脉分离后在 0． 01 g/L BSA 的 M199 中饥饿处理 2 h，接入由注射泵、血管灌流槽和三通管组成的灌流系统，并由压力感受器实时监测血管条内部的压力。用生理盐水平衡 15 min，然后通过调节血管内部压力，分别维持在75、100、125、150 mmHg 下处理30 min，测量血管直径。用含0． 01 g / L BSA 的 M199 重悬HL-60细胞，计数后将 5 × 106/ mLHL-60 细胞约 3 mL 缓慢灌入血管腔，静置 30 min，使其与血管壁相互作用并黏附。为了避免因液体流动带来的剪切力，灌流速度设置为 0． 37 mL/min。最后用生理盐水在低压下灌流10 min，冲洗掉未黏附的细胞，在 10 倍物镜下拍照。实验结果由每个视野中黏附的细胞数得来。

　　1． 2． 2 高机械牵张力刺激下 VCAM-1、P-selectin 影响 HL-60细胞黏附实验 小鼠左右颈总动脉分离、预处理和灌流系统连接同上，由压力感受器实时监测血管条内部的压力。用生理盐水平衡 15 min，然后分别灌流含有小鼠 VCAM-1 抗体、同型 IgG 对照抗体以及 P-selectin 抗体的生理盐水，浓度为10 μg / mL，通过调节血管内部压力，维持在 150 mmHg，对血管做30 min 预处理，以75 mmHg 做对照。为了避免因液体流动带来的剪切力，灌流速度设置为 0． 37 mL/min。用含0． 01 g / L BSA 的 M199 重悬 HL-60 细胞，计数后将 5 × 106/ mLHL-60细胞约 3 mL 缓慢灌入血管腔，分别维持在150 mmHg或75 mmHg 静置 30 min，使其与血管壁相互作用并黏附。最后用生理盐水在低压下灌流 10 min，冲洗掉未黏附的细胞，在10 倍物镜下拍照。实验结果由每个视野中黏附的细胞数得来。

　　1． 2． 3 统计学分析 所有数据采用 SPSS20． 0 进行统计分析，结果以 x ± s 表示，以单因素方差分析，P ＜ 0． 05 表示差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2． 1 机械牵张力引起小鼠颈动脉内皮细胞上 HL-60细胞黏附增加　　　　小鼠颈总动脉管腔内压力从 75 mmHg逐渐升高至 150 mmHg，血管随之直径加大，高压下管腔直径相对于低压时扩大约 150% ( 图 1A) ，随着压力升高，血管及内皮细胞受到的机械牵张力也随之加大。血管内皮细胞在不断增大的牵张力的刺激下，使得 HL-60 细胞黏附逐渐增多，证明机械牵张力能引起 HL-60 细胞在内皮细胞上黏附，并呈明显的牵张强度依赖性( 图 1B) 。【图略】　　　　2． 2 机械牵张力通过 VCAM-1 和 P-selectin 介 导HL-60 细胞的黏附　　　　为证明黏附过程是由 VCAM-1参与 完 成 的，在 加 入 HL-60 细 胞 之 前 分 别 用10 μg / mL VCAM-1 中和抗体、非特异的同型 IgG 对照抗体和 P-selectin 中和抗体，分别对不同的血管条进行预处理。结果表明高腔内压能显著的引起由VCAM-1 参与的 HL-60 细胞黏附过程，高压处理后的血管壁上黏附的 HL-60 细胞明显多于低压处理组，而加入 VCAM-1 中和抗体、P-selectin 中和抗体预处理后的血管，HL-60 细胞黏附数目与非特异性 IgG 预处理后的黏附细胞数目相比有显著的降低，IgG 组与高压组无明显区别( 图 2 ) 。从而证明了机械牵张力通过引起 VCAM-1 在细胞膜上的转移增加来促进HL-60细胞的黏附，其作用与 P-selectin 介导的细胞黏附水平相似。【图2略】　　　　3 讨论

　　血管及其内皮细胞在心脏有规律搏动输出血液的刺激下，受到平行于血管的剪切力和垂直于血管的牵张力两种机械力作用，其中牵张力是内皮细胞感受的重要机械力之一，其广泛存在于多种生理、病理条件下。多项研究表明，高血压时动脉系统扩张，引起牵张力增加，异常的机械力作用于内皮细胞造成内皮受损，细胞内信号转导通路被激活，导致一系列炎症因子释放增加，炎症细胞活化后释放多种酶，溶解破坏内皮细胞，引发的炎症反应使血管壁增厚，造成血管硬化、血管阻力增高血压升高。有文献报导机械力通过激活细胞膜上多种信号分子，引起内皮细胞内复杂的信号转导，这些转导通路对于调节内皮细胞的形态、功能和基因表达起着重要的作用。因此，深入研究机械力学刺激导致或加重高血压形成的机制，减少炎症因子产生，对于预防高血压的发生发展有着重要作用。

　　目前的研究大部分局限于内皮细胞黏附作用的探讨，而对离体组织器官的研究则相对缺乏，故本研究主要针对机械牵张力对离体小鼠颈动脉内皮的作用及细胞黏附展开。为了模拟高血压时血管受力情况，实验采用 Living systems 血管加压装置，通过施加不同程度的静水压，模拟体内升压所致动脉内皮受到不同的牵张应力。内皮细胞表面存在多种炎症细胞黏附因子，目前有关 P-selectin、VCAM-1 等糖蛋白分子研究较多。先前，我们证明了 P-selectin 在牵张力引起的细胞黏附过程中起重要作用，VCAM-1 是否也在其中起作用还不得而知。VCAM-1 是表达于血管内皮细胞膜上的免疫球蛋白黏附分子，可与白细胞表面的 VLA-4 整合蛋白相结合，引起白细胞在内皮细胞表面滚动、黏附。现已证实血液流动剪 切 力 可 引 起 黏 附 分 子 调 控 变 化， VCAM-1、E-selectin 都具有剪 切 应 力 的 依 赖 性，提 示VCAM-1 在牵张力引起的细胞黏附过程中有可能起一定的作用。

　　本研究结果首先显示牵张力可以显著刺激HL-60细胞黏附，并呈压力强度依赖性关系。接着，我们就VCAM-1 在机械牵张力诱导血管炎症细胞黏附过程中的作用进行了探讨。我们发现机械牵张力不仅可以影响由 P-selectin 介导的 HL-60 细胞黏附，同时也可以通过调控 VCAM-1 的变化来影响 HL-60 细胞黏附，并且水平接近。

　　综上所述，本研究结果显示 VCAM-1 和 P-selectin参与了由牵张力诱导的 HL-60 细胞黏附过程，提示机械牵张可以诱导多种细胞因子参与炎症反应。目前该结论仅来自于离体小鼠颈动脉的黏附模型，VCAM-1 和 P-selectin 引起细胞黏附增多的分子机制以及体内血压升高时细胞黏附的情况，还有待于在分子水平、高血压动物模型上得到进一步揭示和验证。深入研究机械牵张力调控炎性细胞黏附的机制，将有助于丰富和完善高血压发病机制的理论，降低血栓和高血压的发生，为探索新的临床治疗方法提供思路。

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