时间：2015-12-20 17:14:39 所属分类：基础医学 浏览量:
缺血再灌注损伤的概念于１９６０年由Ｊｅｎｎｉｎｇｓ提出，其机制较为复杂，除与氧自由基、钙超载、能量代谢障碍等有关外，近年认为与细胞凋亡也有着密切关系。细胞凋亡是生理性或某些因素诱发的程序化细胞死亡，但其细胞信号传导通路并不完全明了。近年研究
缺血再灌注损伤的概念于１９６０年由Ｊｅｎｎｉｎｇｓ提出，其机制较为复杂，除与氧自由基、钙超载、能量代谢障碍等有关外，近年认为与细胞凋亡也有着密切关系。细胞凋亡是生理性或某些因素诱发的程序化细胞死亡，但其细胞信号传导通路并不完全明了。近年研究表明分裂原激活蛋白激酶家 族（ＭＡＰＫ）是一条重要通路，关于其超家族成员ｐ３８ＭＡＰＫ在其中所起作用的研究较少。本研究通过 建 立 缺 血 再 灌 注 损 伤 细 胞 模 型，探 讨ｐ３８ＭＡＰＫ在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用。 １材料与方法 １．１主要试剂与仪器 凯基Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣ细胞凋亡检测试剂盒，ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂（购自Ｓｉｇｍａ公司，ＳＢ２０３５８０），胰蛋白 酶 （Ｇｉｂｃｏ，美 国），新生牛血清 （Ｇｉｂｃｏ，美国），ＤＭＥＭ培养基（高糖）（Ｇｉｂｃｏ，美国），５－溴脱氧尿嘧啶（Ｓｉｇｍａ，美国），Ⅱ型胶原酶（Ｓｉｇｍａ，美国），α－横纹肌肌动蛋白单克隆抗体（ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃａｃｔｉｎ，α－ＳＡ），ＳＡＢＣ免疫组织化学试剂盒，ＤＡＢ显色试剂盒（购自北京博奥森公司，内含ＤＡＢ染色试剂盒、２５ｘＡ显 色 液、２５ｘＢ显 色 液）。荧 光 倒 置 显 微 镜（Ｃａｒｌ ＺＥＩＳＳ）、显微镜（Ｃａｒｌ ＺＥＩＳＳ）、倒置显微镜（ＯＬＹＭＰＵＳ ＴＯＫＹＯ），流式细胞仪（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ ＥＰＩＣＳ Ａｌｔｒａ）。 １．２细胞培养及鉴定 选取１～２ｄ龄ＳＤ乳鼠，在无菌条件下开胸取心脏，将心肌组织放于含有ＤＭＥＭ液的３０ｍｍ培养皿中，用眼科剪刀将心室剪成１ｍｍ３的组织碎块，加入５倍体积的０．０６％胰蛋白酶溶液，混匀后置３７℃恒温箱消化１０ｍｉｎ，静置后吸出上清液，于５０ｍｌ离心管中用２倍体积含１０％新牛血清的ＤＭＥＭ培养液终止消化。重复上述过程６～８次。 将各次消化产物以１ ０００×ｇ离心１０ｍｉｎ，弃上清后将细胞重悬于１０％ Ｇｉｂｃｏ血清培养液中，接种于１００ｍｍ培养皿，在３７℃恒温箱中培养孵育１ｈ，轻轻吸出细胞悬液后，以１０５／ｍｌ的密度分别接种于两个６０ｍｍ培养皿，并置３７℃、５％ＣＯ２恒温箱中培养。 １２ｈ左右更换培养液。用小鼠抗大鼠心肌特异性ＭＨＣａ／Ｉ３、ＴｎＩ抗体（按１∶１００和１∶５０分别稀释）于４℃孵育过夜。然后分别用ＦＩＴＣ标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ及罗丹明标记的山羊抗小鼠ＩｇＧ抗体孵育１ｈ。随机选取１０个视野在荧光显微镜下观察，免疫荧光染色为黄色的细胞为心肌细胞，计数并摄像。 １．３分组及模型建立 取原代培养第３天的心肌细胞按１×１０５的密度种植于２５ｍｍ培养瓶中，将培养成功的心肌细胞随机分成缺血组（Ａ组）、缺血再灌注组（Ｂ组）、Ｐ３８ＭＡＰＫ拮抗剂干预组（Ｃ组）和空白对照组（Ｎ组）。 Ａ组：将模拟缺血液在氮气中饱和１ｈ后，吸出培养液加入模拟缺血液，通入１００％氮气１０ｍｉｎ后马上封闭瓶口，放入恒温箱中培育２４ｈ；Ｂ组：将模拟再灌注液在氧气中饱和１ｈ后，把缺血２４ｈ的细胞培养瓶中的模拟缺血液吸出，加入经９５％ Ｏ２和５％ ＣＯ２的混合气体饱和１ｈ的模拟再灌注液，并通入９５％ Ｏ２和５％ ＣＯ２的混合气体１０ｍｉｎ后迅速封闭瓶口，放入恒温箱中培育１ｈ；Ｃ组：加入ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂ＳＢ２０３５８０（５ｍｍｏｌ／Ｌ），３７℃预孵育１０ｍｉｎ后，按照Ｂ组程序操作。 １．４流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率 将４组心肌细胞用首先用Ｄ－ｈａｎｋｐｓ液清洗１遍，然后加入０．１２５％的胰蛋白酶，将心肌细胞消化下来立即送到流式细胞仪室做流式分析。散点图左上象限显示死亡细胞，左下象限显示活细胞，右上象限显示死亡细胞及后期凋亡细胞，右下象限显示早期凋亡细胞。 １．５ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法检测 ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达用蛋白裂解液提取转染后ＡｎｇⅡ刺激的细胞蛋白，用１５％聚丙酰胺凝胶电泳，１００Ｖ电泳至溴酚蓝达到凝胶的底部，３０Ｖ过夜电转移至硝酸纤维膜上，含５％脱脂奶粉封闭液封闭２ｈ，加入１∶１ ０００鼠抗单克隆抗体，４℃孵育过夜，辣根过氧化物连接的二抗室温孵育２ｈ，加入ＢＣＩＰ／ＮＢＴ显色。用ＧＤＳ８０００凝胶成像系统进行图像分析。 １．６统计学处理 采用ＳＰＳＳ１７．０统计软件统计数据，计量资料以珚ｘ±ｓ表示，两组间比较使用ｔ检验比较。多组比较应用单因素多组方差分析（ＡＮＯＶＡ），组间采用ｑ检验。 ２结果 ２．１各组心肌细胞凋亡的测定结果 各组心肌细胞凋亡率见表１，细胞流式图见图１。 ２．２心肌细胞各组 ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达各组心肌细胞ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达见表２和图２。 ２．３细胞凋亡与ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达的相关性相关性分析显示，细胞凋亡与ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达呈正相关（ｒ＝０．９１８，Ｐ＜０．０１）。 ３讨论 已有研究表明，凋亡是细胞在缺血再灌注损伤过程中的重要死亡形式。细胞在缺血再灌注时激活大量细胞因子，进而激活信号通路，调控细胞的凋亡，但其细胞内的信号转导途径目前仍不十分清楚。ｐ３８ＭＡＰＫ的激活是心肌缺血再灌注损伤中信号转导的一个重要环节，ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路被激活后可磷酸化热激蛋白２７（ＨＳＰ２７）、ＭＡＰＫ干扰激 酶１（ＭＮＫ１）与ＭＮＫ２、细 胞 质 磷 脂 酶Ａ２（ｃＰＬＡ２）等底物，同时向细胞核内传递信号，磷酸化和激活多种蛋白激酶和转录因子，如丝裂原和应激激活的蛋白激酶１（ＭＳＫ１）、血管内皮细胞生长因子（ＶＥＧＦ）等。调控ＤＮＡ的转录，进而发挥增殖、分化、凋亡等，最终表现为加重损伤和延缓损伤两种不同的生物学效应。 目前，ｐ３８ＭＡＰＫ在凋亡中的作用仍有争论。有研究报道在心肌缺血再灌注后ｐ３８ＭＡＰＫ可以大量激活Ｈｓｐ２７，促进细胞应激时紊乱的肌动蛋白修复，使细胞构型保持完整，从而对心肌细胞产生保护作用。但也有研究证实，ｐ３８ＭＡＰＫ在缺血后可以调节ＭＡＰＫ激活蛋白激酶－２、ｃａｓｐａｓｅ－１、ｃａｓｐａｓ－３及ｃａｓｐａｓｅ－１１的激活和ＴＮＦ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６的生成，从而介导凋亡并引起心肌功能的减退。Ｋａｓｉｅｒ等研究发现，ｐ３８ＭＡＰＫ的激活或ｐ３８ＭＡＰＫ基因的过度表达均使缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡明显增加，心功能降低。各实验结论之所以存在差异，可能与ｐ３８ＭＡＰＫ激活后作用于不同的底物，这些促凋亡底物及抑制凋亡底物不平衡有关，也有可能为动物离体研究及人为敲除或增加ｐ３８ＭＡＰＫ基因与在体研究存在差异有关。 本研究表明，心肌细胞在缺血再灌注过程中，ｐ３８ＭＡＰＫ被大量活化为ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ，单纯缺血组和对照组仅有少量活化，使用ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂后ｐ３８ＭＡＰＫ的活化显着减少，差异显着。提示缺血再灌注过程可使ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化为具有生物学活性的ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ。研究显示，缺血组较对照组细胞凋亡率未见明显差异，而缺血再灌注组和对照组相比，凋亡率明显升高，这表明在心肌细胞缺血期，细胞凋亡不是细胞死亡的主要形式，凋亡主要发生在再灌注过程中。使用ｐ３８ＭＡＰＫ抑制剂ＳＢ２０３５８０后，缺血再灌注过程凋亡率明显下降，说明ｐ３８ＭＡＰＫ的活化促进了细胞的凋亡，是心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的重要信号途径。但使用ｐ３８ＭＡＰＫ后抑制剂组的细胞凋亡率仍高于缺血组，表明除了ｐ３８ＭＡＰＫ信号通路调控细胞凋亡过程外，还有其他信号通路参与心肌细胞的凋亡。这与我们动物实验的结果相一致。 心肌缺血再灌注损伤的机制较复杂，ｐ３８ＭＡＰＫ仅为其中信号转导途径之一。目前ｐ３８ＭＡＰＫ各级联反应的功能及生物学特性尚不明确，级联反应的上下游激酶及作用的底物亦不十分清楚。但随着实验平台的搭建及技术的深入，相信ｐ３８ＭＡＰＫ信号途径在心肌缺血再灌注损伤中的机制会越来越清晰。而在信号传导途径水平进行药物干预，也将为防治心肌再灌注损伤提供有利手段，同时也为缺血性心脏疾病的基因治疗提供新的线索和思路。 参考文献 ［１］ 张奇，白晓东，付小兵．Ｐ３８ＭＡＰＫ信号传导通路研究进展［Ｊ］．感染、炎症、修复，２００５，６（２）：１２１－１２３． ［２］ＧＨＡＴＡＮ Ｓ，ＬＬＴＬＬＬＥＲ Ｓ，ＫＩＮＯＳＨＩＭ Ｙ，ｅｔ ａｌ．ｐ３８ ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂａｘｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｉＩＩ ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ－ｌｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉＩｌ ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０００，１５０：３３５－３４７． ［３］ＬＩ Ｇ Ｆ，ＩＭＴＩＡＺ Ｓ Ａ，ＷＩＬＬＩＡＭ Ｃ．Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒａｔ ｈｅａｒｔｓ ｒｅ－ｑｕｉｒｅｓ ｐ３８ＭＡＰＫ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｓｐ２７［Ｊ］．Ａｍ ＪＰｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，２９４：Ｈ７４－Ｈ８７． ［４］ＷＡＮＧ Ｍ，ＴＳＡＩ Ｂ Ｍ，ＴＵＲＲＥＮＴＩＮＥ Ｍ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｐ３８ ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｂｏｔｈｄｅａｔｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｒｔ［Ｊ］．Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ，２００５，８０：２２３５－２２４１． ［５］ＳＴＥＥＲ Ｍ Ｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｒｅｓｐｉｒａｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００１，１２８：１３－１６． ［６］ＳＨＩ Ｃ，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ Ｒ，ＺＨＡＯ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔ－ｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｏｒｇａｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ，２００５，５：４９２－５００． ［７］ＫＡＳＩＥＲ Ｒ Ａ，ＢＵＥＮＯ Ｏ Ｆ，ＬＩＰＳ Ｄ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅ－ｔｅｄ ｉｎｈｉｂｉ－ｔｉｏｎ ｏｆ ｐ３８ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ ｃａｒｄｉａｃ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｓ－ｃｈｅｍｉａ－ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９：１５５２４－１５５３０． ［８］ 任澎，刘永国，李喆，等．ｐ３８丝裂原活化蛋白激酶介导大鼠心肌缺血再灌注损伤信号传导的研究［Ｊ］．中国循环杂志，２０１２，１０（２７）：３８７－３９０转载请注明来自：http://www.zazhifabiao.com/lunwen/yyws/jcyx/20448.html
