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探讨IL-37对单核巨噬细胞的泡沫化的作用及机制

时间:2015-12-20 17:16:06 所属分类:基础医学 浏览量:

动脉粥样硬化(AS)是一种累及全身血管的慢 性病变。AS不仅仅是脂质代谢紊乱,同时也是一种慢性炎症性疾病,多种免疫细胞及细胞因子参与了其发生与进展。单核细胞迁移到内皮下转化为具有吞噬作用的巨噬细胞,通过清道夫受体(scav-enger rec

动脉粥样硬化(AS)是一种累及全身血管的慢 性病变。AS不仅仅是脂质代谢紊乱,同时也是一种慢性炎症性疾病,多种免疫细胞及细胞因子参与了其发生与进展。单核细胞迁移到内皮下转化为具有吞噬作用的巨噬细胞,通过清道夫受体(scav-enger receptor,SR)吞噬脂质形成泡沫细胞,释放一系列炎性因子及趋化蛋白,启动炎症级联反应,促进AS进展。此外,泡沫细胞沉积于内皮下,导致内膜进一步改变。白细胞介素(IL)被认为是调节AS进展中泡沫细胞形成的关键因素。  IL-37能够抑制多种炎性因子的表达,平衡体内促炎因子与抑炎因子,抑制树突状细胞的活化,减轻炎症 反应。有实验在AS组织泡沫细胞中检测到IL-37蛋白表达,但其能否影响单核巨噬细胞的泡沫化尚未明确。本研究以人单核细胞系THP-1为对象,体外模拟巨噬细胞泡沫化的过程,观察IL-37的作用,并对可能机制进行探讨。  1材料与方法  1.1材料  THP-1细胞系购自美国ATCC公 司,RPMI1640及胎牛血清购 自Gibic公 司,ox-LDL购 自Yiyuan Biotechnologies公司,小鼠抗人ABCA-1单克隆抗体(sc-58219)购自美国SANTA CRUZ公司,β-Actin(sc-47778)购自美国SANTA CRUZ公司,兔抗人CD36单克隆抗体购自美国EPITOMICS公司,小鼠 抗 人SR-A单克隆抗体购自美国R&D公 司,Trizol及RT-PCR试 剂 盒 购 自 日 本Takara公 司,CD36引物、SRA引物、ABCA-1引物、GAPDH引物由中国武汉擎科生物公司设计合成。  1.2方法  1.2.1 THP-1细胞培养THP-1细胞为悬浮生长细胞,用含10%FBS的RPMI1640培养基,培养基加入青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml),37℃、5% CO2培养箱中静置培养,每2~3d传代1次。  1.2.2巨噬细胞的分化1 000×g、5min离心上述培养的THP-1细胞,弃上清,按1×106/ml重悬于新的培养基中,接种到6孔板或者细胞培养瓶中,加入PMA(终浓度为160nmol/L),37℃、5%CO2培养箱中静置培养24h,观察细胞贴壁和形态改变。  1.2.3分组及建立泡沫细胞模型THP-1细胞(1×106/ml)在160nmol/L PMA刺激24h分化为巨噬细胞,然后分别给予ox-LDL(50mg/ml)、ox-LDL(50 mg/ml)+IL-37(5ng/ml)、ox-LDL(50mg/ml)+IL-37(10ng/ml)、ox-LDL(50mg/ml)+IL-37(20ng/ml)。各组细胞均置5% CO2、37℃孵箱,培养24h。其中仅给予ox-LDL(50mg/ml)单独刺激的对照组再进行进一步分组实验,一组给予IL-37(10ng/ml),另一组仅更换新鲜培养基,24h后收集细胞。  1.2.4油红O染色观察泡沫细胞形态将THP-1培养于放有盖玻片的6孔培养板内,用PMA刺激24h后,加入ox-LDL和(或)IL-37干预24h。待处理结束后,弃上清,用预冷PBS液冲洗3次。4%多聚甲醛固定2~4min,0.3%油红O染色液染色15~20min,苏木素染色5min,盐酸酒精分色,明胶甘油封片,显微镜观察。收集图像并用图像分析系统分析。  1.2.5细胞内脂质测定弃干预后的细胞培养液,用预冷PBS冲洗3次,冰浴30min,用细胞刮刮下细胞,800×g离心10min,加入0.5ml的氯仿-甲醇(2∶1)混合液研磨,3 000×g、4℃离心30min,取上清液,加两倍体积的冰生理盐水,3 000×g离心30min,去除上层液体,将下层有机相转移到干燥的EP管,用TC试 剂 盒 测 定TC,沉 淀 用0.1mmol/L NaOH 0.2ml溶解,BCA法测细胞内蛋白质含量。细胞内胆固醇含量用每克蛋白所含的TC表示。  1.2.6 RT-PCR检测RNA提取上述干预后的细胞,用预冷PBS冲洗3次,每孔加入1ml Trizol,静置10 min,用枪吹打 数次,吸入无RNA酶 的1.5ml EP管中,每管加入200μl氯仿,震荡数秒,室温静置10min,12 000×g、15min,4℃,离心;吸取上层液体层200~300μl到另一EP管中,等体积加入预冷的异丙醇,轻轻混匀,-20℃,放置10min,12 000×g、15min,4℃离心;弃上清,加入1ml预冷无水乙醇,7 500×g、10min,4℃,离心;尽最大可能将上清丢弃,加入20μl的DEPCH2O。  RNA浓度和纯度测定取1μl所提取的DNA溶液加入99μl DEPC水,充分混匀,然后用核酸分析仪检测A260,A260/A280比值,RNA浓度(mg/ml)=A260×100×稀释倍数,A260/A280比值在1.8~2.0纯度较高。逆转录温度梯度PCR仪按37℃15min、85℃5s、4℃的程序进行逆转录。  PCR引物序列 引 物 序 列 如 下:  GAPDH:5′-CCACCCATG-GCAAATTCCATGGCA -3′,5′-TCTAGACCGCAGGTCAGGTCCACC-3′;CD36:5′-GAGAACTGTTAT-GGGGCTAT-3′,5′-TTCAACTGGAGAGGCAAAG-G-3′;SR-A:5′-CCAGGGACATGGAATGCAA-3′,5′-CCAGTGGGACCTCGATCTCC-3′;ABCA1:5′-TGT-CCAGTCCAGTAATGGTTCTG -T3′,5′-AAGCGA-GATATGGTCCGGATT -3′。  RT-PCR按Takara公司PCR试剂盒说明,按ROX 0.2μl,SYBR?Premix ExTaqTM II 5μl,PCR Forward Primer 0.2μl,PCR Re-verse Primer 0.2μl,DNA模板1μl,dH2O 3.4μl,配制10μl扩增体系;采取两步法PCR扩增标准程序:95℃、30s,95℃、5s,60℃退火、延伸30s,共40个循环。  1.2.7 Western印迹检测蛋白质提取上述干预后的细胞,预冷PBS冲洗3次,细胞刮用力将细胞刮落,用1ml PBS重悬于1.5ml EP管中,3 000×g、10min,4℃离心,弃上清,加入现配的与沉淀体积约等的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂复合物,将沉淀吹散,冰浴30min,30s、6次涡旋,间隔5min进行1次;12 000×g、10min,4℃,离心;吸取上清为细胞蛋白质。蛋白浓度测定和变性按照BCA蛋白测定试剂盒的说明,用酶标仪检测样本的蛋白浓度。而后按每个样本上样60μg分装样本到200μl的EP管中,95℃、10 min,使蛋白变性。  Westernblot电泳按浓缩胶60~80V恒压,分离胶100~150V恒压,到蛋白Marker条带区分明显或者溴酚蓝到达分离胶最低端;转膜用300mA恒流,根据目标蛋白分子量大小决定转膜时间;5%脱脂奶粉封闭3h,TBST洗涤5min、3次,一抗按说明书要求稀释,摇床冰浴过夜;TBST洗涤5min、3次,二抗按1∶3 000稀释,封闭2h;TBST洗涤5min、3次,用Image Lab成像系统检测并收集图像。  1.3统计学处理  实验均重复3次,实验数据以珚x±s表示,采用SPSS12.0作统计学处理。组间数据处理根据方差齐性分析的结果,进一步使用SNK检验,进行组间差异的比较,P<0.05为差异有统计学意义。  2结果  2.1泡沫细胞形态及细胞内脂质测定光固定和油红O染色光镜下显示,IL-37+ox-LDL组细胞摄取ox-LDL减少,胞内脂质小滴显着减少,油红O染色阳性细胞较ox-LDL组显着减少,且细胞形态多改变较 少 (图1)。IL-37+ox-LDL组巨噬细胞内TC水平较ox-LDL组显着减少[(150.4±7.36)ng/mg∶(303.1±8.9)ng/mg,P<0.01]。    2.2 THP-1源巨噬细胞CD36、SRA及ABCA-1的表达水平Ox-LDL(50mg/ml)组和IL-37(10ng/ml)+ox-LDL(50mg/ml)组THP-1源巨噬细胞CD36、SRA及ABCA-1蛋白及mRNA表达水平见表1,不同浓度ox-LDL组表达水平见表2。    2.3泡沫细胞CD36、SRA及ABCA-1的表达水平Ox-LDL(50mg/ml)组和IL-37(10ng/ml)+ox-LDL(50 mg/ml)组 泡 沫 细 胞CD36、SRA及ABCA-1蛋白及mRNA表达水平见表3。  3讨论  AS是是一种多因素参与的病理过程。脂质代谢紊乱和炎症反应是致AS的最主要的两个原因,彼此相互促进,加速AS的进展。血液中的单核细胞迁移进入内皮下分化为巨噬细胞,通过SR吞噬血管内膜下聚集的脂质尤其是ox-LDL形成泡沫膜细胞,启动AS的进程。泡沫细胞聚集形成斑块是AS的主要病变特征,同时泡沫细胞的形成启动了动脉内皮下慢性炎症级联反应,促进病变的进展。  研究表明,多种细胞因子在AS泡沫细胞的形成中发挥了重要作用。这些细胞因子可以通过上调或下调巨噬细胞表面SR,调节巨噬细胞对脂质的摄取,促进或者抑制泡沫细胞的形成;也可以通过上调或下调巨噬细胞逆向脂质运输相关蛋白的表达,延缓或加速泡沫细胞的形成。巨噬细胞通过细胞表面表达的一系列SR识别、摄取内皮下脂质;同时也表达逆向胆固醇转运蛋白,处理胞内聚集的脂质;二者的失衡将影响泡沫细胞的形成。  本实验表明,IL-37能够抑制THP-1源巨噬细胞摄取ox-LDL,促进胞内脂质外流,减少泡沫细胞的形成,具有抗AS的作用。我们通过油红O染色从形态学观察到IL-37能够减少THP-1源巨噬细胞形成泡沫细胞,降低THP-1源巨噬细胞胞内TC的聚集。与IL-10通过多种机制减少泡沫细胞的形成,其中有些存在争议。本实验明确了IL-37抑制泡沫细胞的机制,与IL-33、TGF-β相似,IL-37通过抑制SRA和CD36,同时增强逆向胆固醇运输蛋白ABCA1的表达,减轻巨噬细胞脂质负荷,减少泡沫细胞的形成,且该作用具有浓度依赖性。此外,用IL-37和PMA同时刺激THP-1的分化,能够减少巨噬细胞的形成,并且抑制所活化的巨噬细胞形态的改变,如变形、伸出伪足的细胞明显减少,与之前的研究一致。  研究表明,IL-37具有下调多种炎性因子的作用,减少体内树突状细胞的数量,且可以下调树突状细胞表面蛋白CD86和MHCⅡ表达量,减轻固有免疫和适应性炎症反应。与IL-33和IL-1α相似,IL-37具有双重生物学活性,一方面作为可溶性细胞因子,通过与IL-18α或者IL-18BP结合,发挥抗炎作用,但是详细的机制尚未阐明;另一方面成熟的IL-37作为核转录因子进入细胞核,与Smad3相互作用,调节多条信号通路的关键酶,包括FAK、PyK2、MAPKp38、STATs1-4等。转染IL-37的THP-1细胞,受到LPS和IFN-γ刺激后,与对 照 组 相 比,FAK、Pyk2、MAP kinase p38α、STATs、p53、TOR的表达显着下调[1];其中STAT是脂质代谢JAK/STAT信号通路的关键转录因子,通过调控ABCA1的表达影响吞噬细胞逆向转运胞内脂质;此外,mTOR信号通路、MAPK信号通路也参与了巨噬细胞的脂质代谢。所以,我们推测成熟的IL-37进入细胞核后,与Smad3结合,通过多条脂质代谢通路调节巨噬细胞SR和胆固醇逆向转运受体的表达,调控巨噬细胞泡沫化,从而影响AS的进程。  SR和逆向胆固醇转运蛋白是巨噬细胞泡沫化的关键因素,SRA和CD36是巨噬细胞结合和摄取ox-LDL的主要受体,ABCA1是巨噬细胞内胆固醇外流的重要转运体。敲除CD36基因后小鼠以及同时敲除CD36,SRA基因小鼠AS进程明显延缓;而上 调ABCA1则 能 够 延 缓AS的 进 展,表 明CD36、SRA和ABCA1起着重要的作用。本实验结果表明,IL-37可以显着抑制CD36和SRA的表达,促进ABCA-1的表达,且有剂量依赖关系。此外,对 已 形 成 的 泡 沫 细 胞,IL-37也 能 显 着 上 调ABCA1,下调SRA和CD36的表达。  综上所述,IL-37具有抗AS的作用。结合之前关于IL-37具有下调多种炎性因子、抑制炎性细胞活化、减轻炎症反应的研究,相信IL-37有可能会成为AS预防和治疗的新靶点。  参考文献  [1]NoLD M F,NOLD-PETRY C A,ZEPP J A,et al.IL-37is a fundamental inhibitor of innate immunity[J].Nat Immunol,2010,11:1014-1022.  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