时间：2015-12-20 17:31:16 所属分类：药学 浏览量:
裸花紫珠为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook Et Arn.)的干燥叶,其性凉、味苦涩,微辛,具有消炎,解毒,收敛,止血之功效,用于化脓性炎症,急性传染性肝炎,外治烧、烫伤,外伤出血等症[1]。紫珠属植物的化学成分研究表明,苯乙醇苷类成分是该属
裸花紫珠为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook Et Arn.)的干燥叶,其性凉、味苦涩,微辛,具有消炎,解毒,收敛,止血之功效,用于化脓性炎症,急性传染性肝炎,外治烧、烫伤,外伤出血等症[1]。紫珠属植物的化学成分研究表明,苯乙醇苷类成分是该属植物的主要类群成分之一[2]。在前期研究中发现,毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷是裸花紫珠水提液中的主要成分。作为苯乙醇苷的代表性成分,毛蕊花糖苷具有止血[3]、保肝降酶[4-5]、抗菌[6]、抗炎[7]、抗氧化[8]、抗肿瘤[9]等多种药理作用,可能是其发挥药效的主要活性成分。
裸花紫珠水提取液固形物收率在30%以上,其中蛋白质、粘液质、叶绿素、无机盐、重金属等的含量较高,这些成分多为杂质成分或无效成分。为提高裸花紫珠制剂的产品质量,有必要对其水提取液进行精制纯化,在保留有效成分的同时最大限度地除杂,并尽可能减少有效成分的损失。目前中药水提取液常用纯化方法有水提醇沉、高速离心、澄清剂吸附、膜分离、大孔吸附树脂、微滤等[10],而壳聚糖澄清剂对蛋白质、粘液质、鞣质、核酸等物质均具有吸附能力,除杂完全,并且能有效保留功能性成分。因此本研究采用壳聚糖澄清技术对裸花紫珠水提液进行澄清处理,采用正交试验优选较佳的澄清工艺条件,为裸花紫珠水提取液进一步精制纯化奠定基础。
1 材料与方法
1.1仪器LC-2010AHT高效液相色谱仪,配有紫外检测器,自动进样器,LC solution色谱工作站(日本岛津公司);AL-104电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);85-2A磁力加热搅拌器(金坛市城东新瑞仪器有限公司);DK-98-ⅡA型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司);TDL-5离心机(上海安亭科学仪器厂);202AB-1电热干燥箱(上海申光仪器仪表有限公司);九阳电磁炉(九阳股份有限公司)。
1.2材料与试剂裸花紫珠药材与2013年8月采自海南省白沙县,经鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(C.nudiflora Hook EtArn.)的干燥叶;甲醇,冰醋酸,无水乙醇均为分析纯,购自广州化学试剂厂;乙腈为色谱纯,水为超纯水;壳聚糖购自山东奥康生物科技有限公司;毛蕊花糖苷(批号:120804)与异毛蕊花糖苷对照品(批号:130512)购自四川维克奇生物科技有限公司。
1.3裸花紫珠水提取液的制备取裸花紫珠叶300g,置10L圆底烧瓶中,加入6L蒸馏水浸泡2h,加热回流提取1h,过滤,滤渣再加蒸馏水加热回流提取2次,每次4.5L,过滤,合并三次滤液,浓缩至600mL(每毫升水提取液含生药0.5g),作为原药液。分别加水稀释至1∶4(0.25g/mL)、1∶8(0.125g/mL)和1∶12(0.083g/mL)的溶液备用。
1.4壳聚糖溶液的配制取壳聚糖粉末1g,加1%冰醋酸溶液适量,静置2h,搅拌使其溶解,再加1%冰醋酸溶液至100mL,配成含壳聚糖质量分数为1%的溶液,静置24h使充分溶胀,双层纱布过滤,即得。
1.5毛蕊花糖苷(AS)和异毛蕊花糖苷(IAS)的测定1.5.1色谱条件色谱柱:Luna C1 8(2)(150 mm ×4.6mm,5μm),流动相:乙腈-0.1%醋酸溶液(15∶85);流速:1.0mL/min,检测波长:332nm;柱温:30℃。
1.5.2对照品溶液的制备精密称取毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对照品,置25mL量瓶中,加50%甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,配成每毫升溶液含毛蕊花糖苷0.104 4mg,异毛蕊花糖苷0.102 4mg的混合对照品溶液。取适量,过0.45μm微孔滤膜,取续滤液备用。
1.5.3供试品溶液的制备取裸花紫珠水提取液澄清前后溶液适量,置25mL量瓶中,加入50%甲醇溶液稀释至刻度,取适量,过0.45μm微孔滤膜,取续滤液,即得。
1.5.4标准曲线的绘制精密吸取混合对照品续滤液,注入高效液相色谱仪,进样体积分别为1、2、4、8、10、12、16μL,测定毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的峰面积,分别以毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的进样质量(μg)为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得毛蕊花糖苷的回归方程为YA S= 1628385 X -22263.7(r=0.9998),线性范围为0.1044~1.6704μg;异毛蕊花糖苷的回归方程为YIA S=1458350 X-24579.6(r=0.9999),线 性 范 围 为0.1024~1.6384μg。
1.5.5含量测定分别精密吸取对照品和供试品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,测定,记录色谱图峰面积,计算毛蕊花糖苷(AS)和异毛蕊花糖苷(IAS)含量,即得。
1.6评价指标 1.6.1固形物去除率的测定精密量取裸花紫珠水提液澄清前后溶液各20mL置已干燥至恒重的蒸发皿中,水浴蒸干,并于105℃加热干燥3h,迅速转移至干燥器中冷却30min后精密称定质量,按以下公式计算固形物去除率。
固形物去除率=(澄清前固形物质量-澄清后固形物质量)/澄清前固形物质量×100%1.6.2毛蕊花糖苷(AS)和异毛蕊花糖苷(IAS)含量的保留率采用HPLC分别对澄清前后溶液中毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量进行测定,根据以下公式计算毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量的保留率。(AS+IAS)保留率=澄清后溶液中(AS+IAS)的含量/澄清前溶液中(AS+IAS)的含量×100%1.6.3综合评分(Overrall Desirability,OD)在用壳聚糖澄清剂对裸花紫珠水提取液进行除杂处理时,既需要最大限度地保留目标有效成分,又需要保证较好的澄清效果,所以选取固形物去除率(Y1)和(AS+IAS)保留率(Y2)一同作为评价指标进行综合评分,将Y1的权重设为0.4,Y2的权重设为0.6,则OD=(Y1/Y1ma x×0.4+ Y2/Y2ma x×0.6)×100%。
2 结果
2.1壳聚糖澄清工艺参数考察
参考相关文献[11-13],影响水提液澄清效果的因素主要有药液浓度、澄清剂用量、澄清温度、搅拌速度、溶液的pH、静置时间、水浴保温时间等,通过预试验,本研究选取药液浓度(A)、壳聚糖用量(B)、澄清温度 (C)、搅拌速度 (D)4个因素进行考察,每个因素考察3个水平,因素水平见表1。【1】
按L9(34)正交表安排试验,以固形物去除率和AS+IAS含量的保留率为考察指标,进行综合评分。对综合评分值进行直观分析和方差分析,试验安排及结果见表2,方差分析结果见表3。【2】
2.2结果分析
根据壳聚糖澄清剂对裸花紫珠叶水提取液澄清工艺考察结果可知,以综合评分值进行直观分析,各因素影响大小顺序为B>A>C>D,方差分析结果,因素B(壳聚糖用量)对结果具有显着性差异,故最优方案为A3B3C2D1,即药液浓缩至含生药质量浓度1∶12(0.083g/mL),壳聚糖澄清剂加入量为药液体积的12%,絮凝温度70 ℃,搅拌速度为100r/min。
2.3工艺验证取裸花紫珠水提药液3份,每份25mL,按优选的澄清工艺 进 行 处 理,结 果 固 形 物 去 除 率 分 别 为19.85%、20.62%、21.05%,平均去除率为20.51%,RSD为2.96%;毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量之和的保留率分别为89.35%、91.28%、90.10%,平均保留率为90.24%,RSD为1.08%,说明优选的工艺稳定可行。
3 讨论
吸附澄清法是在中药提取液或提取浓缩液中加入一种絮凝剂,通过高分子的电中和、吸附架桥等作用,使体系中的悬浮物及胶体粒子除去,使体系的澄明度得以提高的一项高新技术。壳聚糖用于中药水提液的澄清主要与其吸附性能和絮凝作用有关,可除去药 液 中 的 蛋 白 质、粘 液 质、果 胶 等 大 分 子 物质[14]。
在运用吸附澄清技术除杂时必须考虑到有效成份的保留率。同时,也要考察固形物的收率,即是否能够有效地降低服用剂量,达到精制的目的,更重要的是保证成品制剂的有效性。因此,通常应从有效成份保留率、固形物收率以及主要药效学等多方面进行指标考察,筛选合理可行的除杂工艺,对中药水提液进行精制处理。
本研究采用壳聚糖对裸花紫珠水提取液进行澄清处理,以固形物去除率和水提液中有效成分-毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量的保留率为考察指标并对其澄清工艺进行优化,得到壳聚糖澄清裸花紫珠水提液的较佳工艺。在此工艺条件下固形物平均去除率为20.51%,毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷含量的平均保留率为90.24%。研究结果表明,壳聚糖对裸花紫珠水提液有明显的絮凝澄清作用,固形物去除率较高,药液的澄清度高,而且有效成分毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的损失率较低。应用过程中不会带入无机离子,具有加量少,操作简单,安全无毒等优点,是一种适用于工业化生产的絮凝工艺。
该工艺克服了传统醇沉法存在的缺点,工艺简单,成本低廉,为工业化生产应用提供了参考。
参考文献 1海南省食品药品监督管理局.海南省中药材标准(第一册)[S].海口:南海出版社,2011:147-148. 2 Tu YH,Sun LN,Guo ML,et al.The medicinal uses of Callicar-pa L.in traditional Chinese medicine:An ethnopharmacologi-cal,phytochemical and pharmacological review[J].Journal ofEthnopharmacology,2013,146(1):465-481. 3张洁,李宝泉,冯锋,等.裸花紫珠的化学成分及其止血活性研究[J].中国中药杂志,2010,35(24):3297-3301. 4颜芳,曾光尧,谭健兵,等.植物中苯乙醇苷类化合物研究进展[J].中南药学,2013,11(5):358-361.
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