革兰氏阳性菌感染对甘蔗光合作用的影响

时间：2015-12-21 00:06:13 所属分类：植物保护 浏览量:

甘 蔗 宿 根 矮 化 病 （ratoon stunting disease,RSD）是世界甘蔗种植国家普遍发生的一种病害。甘蔗是广西重要的经济作物，广西和云南甘蔗主栽品种RSD发 病 率 高，阳 性 检 出 率 达59.64%[1].RSD是由Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）引起，主要寄居在维

　　甘 蔗 宿 根 矮 化 病 （ratoon stunting disease,RSD）是世界甘蔗种植国家普遍发生的一种病害。甘蔗是广西重要的经济作物，广西和云南甘蔗主栽品种RSD发 病 率 高，阳 性 检 出 率 达59.64%[1].RSD是由Leifsonia xyli subsp.xyli（Lxx）引起，主要寄居在维管束木质部导管内，属革兰氏阳性菌[2].Davis等[2]首先实现了Lxx的体外分离培养，并命名为Clavibacter xyli subsp.xyli（Cxx）。Evtushenko等[3]根据rRNA和基因组内高G+C含量等特点，将其更名为Leifsonia xyli subsp.xy-li（Lxx）。适 合Lxx体 外 培 养 的 培 养 基 有SC、SCM、DM和S8等[4].Brumbley等[5]对SC培养基进行改良获得MSC培养基，优化了单菌落生长条件。Monteiro-Vitorello等[6]以Lxx纯培养物或感染RSD甘蔗为材料，完成了宿根矮化病原菌的基因组测序，发现果胶酶基因、纤维素酶基因和ABA合成基因可能是Lxx的致病基因；Young等[7]分析了来自澳大利亚、印度尼西亚、日本、美国等9个国家Lxx的16SRNA后，发现序列间没有差异；陈明辉等[8-9]研究发现甘蔗感染RSD后体内赤霉素和生长素明显降低，脱落酸明显升高，株高、茎径、节间长度和单茎重也明显降低。

　　甘蔗的光合作用与产量有密切联系，而RSD可导 致 甘 蔗 产 量 下 降5% ~30%,严 重 时 可 达60%[10],因此，研究RSD感染对甘蔗光合作用影响有重要意义。但因Lxx很难进行体外分离培养，使得研究RSD病原菌的致病机制及其与甘蔗寄主间的互作机制受到限制，关于Lxx侵染对甘蔗光合作用的影响也未见报道。本试验以感染RSD的甘蔗品种Badila为材料，观察Lxx在蔗茎内的定殖情况，进行体外分离培养Lxx后，接种到甘蔗品种桂糖11号（GT11）和Badila健康甘蔗种茎上，并以不接菌为对照，分析不同时期甘蔗光合作用的变化，旨在研究Lxx的侵染特性和RSD胁迫对甘蔗光合作用的影响，为进一步探讨Lxx与寄主互作机制提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1病原菌的分离与培养

　　选取疑似感病果蔗（Badila），采用PCR检测是否感染RSD[11].确认带病后砍取感病蔗茎基部，除掉杂质和蜡粉，自来水冲洗干净后用去离子水冲洗2遍并喷洒酒精，在酒精灯火焰上快速消毒后去皮，切成5cm长的小段，放入灭菌的50mL离心管内，于3 500r/min室温下离心15min.收集离心管底部蔗汁，用 定 量 中 速 滤 纸 初 步 过 滤，再 过 孔 径0.45μm滤膜，把过滤除菌的蔗汁接种在MSC培养基上。待菌液完全被吸收后用封口膜封好，倒置于28℃恒温培养箱中培养。培养基配方参照Brumb-ley等[5],略加修改。培养基配方（1L）：高压灭菌组分包括Corn meal agar 17g,Bacto-agar 4g,Bacto-peptone 8g,Bovine hemin chloride（0.1%solution in0.05mol/L NaOH）30mL,MgSO40.2g,K2HPO4（0.1mol/L）13mL,KH2PO4（0.1mol/L）87mL,加去离子水至900mL,并用10mol/L NaOH调至pH7.5;过滤除菌组分包括Glucose 2g,Cysteine,freebase 0.5g,Bovine serum albumin,fraction V 2g,加去离子水至100mL,过孔径0.22μm滤膜后加入高压灭菌成分中并轻摇混匀。

　　1.2电镜样品的制备

　　扫描电镜样品制备：取PCR检测带菌蔗茎基部切成5mm×5mm小块，放入3%戊二醛中固定2h以上，PBS缓冲液清洗3次，50%、70%、80%、90%、100%乙醇依次脱水，六甲基二硅胺烷洗3次后抽真空，粘座，IB3离子溅射仪喷镀后用Tescan Vega 3扫描电镜观察并拍照。

　　透射电镜超薄切片制备：将收集到的菌液8 000r/min,离心5min成菌团，弃掉PBS上清液，换用ddH2O,同样的方法冲洗菌团2遍后，立即加入3%戊二醛固定过夜。固定后于0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次，每次15min,在1%锇酸中固定1~2h,然后用乙醇-丙酮逐级脱水：50%、70%、80%、90%乙醇、1/1混合液（90%乙醇/90%丙酮）、90%丙酮、3次100%丙酮（各级每次15min）。浸透：丙酮/包埋剂=1/1渗透1h,（1/3）渗透1~3h或过夜，最后纯包埋剂全浸透2h.再用纯包埋剂（环氧树脂618）包埋，并按35℃/5h、45℃/12h、60℃/24h聚合后修块，用徕卡UC7超薄切片机切片，经醋酸铀-柠檬酸铅双重染色后，用日立H-7650型电子显微镜观察、拍照。

　　透射电镜负染样品制备：用0.01mol/L的PBS把已培养15~20d且长势良好的菌落从培养基表面冲洗下来，收集于灭菌的1.5mL离心管中。取1滴Lxx菌悬液于铜网上，用1%磷钨酸染色2~5min,晾干后置于透射电镜上观察。

　　1.3接菌试验

　　选取种植在广西大学农学院温室大棚内的甘蔗品种桂糖11号（GT11）和果蔗（Badila）作为试验材料。用PCR检测生长长势良好、无病虫害的蔗株，确认不带病后砍成单芽段，经50℃温汤脱菌2h,获得无病种茎。在单芽段两个切面上接种108cfu/mL的菌液300μL,分接菌处理和接种0.1mol/L PBS的对照处理，28℃催芽2d.于2014年1月21日沙培育苗，待 其长至3叶期时移栽营养桶（直 径300mm,高350mm）内土培。每处理6桶，每桶3株。土壤经过阳光暴晒3d,每桶土20kg.土壤养分，N/P/K比例为86.67/31.00/129.33.待其长至6~7叶时，PCR再次检测，确定侵染蔗株感染上RSD.

　　随机选取接菌处理中确认感染RSD的蔗株和对照处理蔗株各6株，分别在接菌后120、150、180、210d,用LI-6400XT光合仪在晴朗的上午9:00~11:00测 定+1叶 净 光 合 速 率 （Pn）、气 孔 导 度（Cond）、胞间CO2（Ci）和蒸腾速率（Tr），温度和湿度均为环境 水平，人工光 源，光量子通量密度为1 500μmol/（m2·s）。

　　1.4数据分析

　　使用SPSS 15.0软件和Excel 2007对试验数据进行统计分析。

　　2结果与分析

　　2.1病原菌的菌落与鉴定

　　28℃恒温培养15~20d后，培养基表面有细小的菌落长出。菌落圆形、无色透明、边缘整齐且中间隆起，直径0.1~0.3mm.再生长2周后，菌落颜色略显乳白色，菌落直径也稍增大，可达0.5mm.

　　用数码照相机对菌落进行拍照（图1-A,B）。随机挑取5个菌落进行PCR[19]检测，待测菌落均能扩增出与正对照一致的目的条带（图1-C）。对目的条带进行胶回收，连接到pM18-T载体后转入大肠杆菌中表达，经双向测序 测得片段大小为438bp,与Genbank数 据 库 中Lxx的 相 应 区 段 序 列（AE016822、AF034641、DQ232616.2）比对，同源性均为100%,故可确认为RSD病原菌。

　　2.2病原菌的形态特征

　　从扫描电镜和透射电镜观察的结果可知，Lxx菌体表面光滑，无鞭毛，菌体有多种形态，多数呈棒形，有的具不同程度弯曲，有的一端或中部略微膨大，少 数 呈 “V”形，大 小 为 （0.16~0.32）μm×（1.1~3.2）μm,并可见部分细胞内有简体与隔膜存在（图2-A,B,C）。

　　Lxx的超薄切片显示其细胞壁光滑，细胞质分布不均，内有电子透明物、电子稠密物，可观察到隔膜将细胞分隔（图2-D）。

　　从图2-E可见蔗茎维管束横切面上2个大而圆的后生木质部导管（M），初生木质部导管（P）在后生木质部导管中间，气腔（L）靠近初生木质部导管，另外还可见韧皮部（Ph）和纤维细胞（Vf）存在于导管周围。

　　从图2-F可见蔗茎3种导管，分别为网纹导管（Rv）、环纹导管（Av）和螺纹导管（Scv）。从图2-G可见蔗茎螺纹导管纵切面的纹孔中观察到Lxx菌体，与用电镜观察纯菌体时所得形态相一致，其大小相近。在导管内的纹孔及导管壁上可见许多圆形颗粒状物质粘附（图2-H），但在健康蔗茎导管内未见Lxx菌体及颗粒状物质。

　　2.3病原菌侵染对甘蔗光合作用的影响

　　由图3可知，GT11和Badila感染RSD蔗株的净光合速率均低于对照。

　　GT11接菌处理120、150、180、210d后分别比对照降低了13.13%、21.66%、21.87%、20.64%,且差异均极显着。

　　Badila接菌处理120、150、180、210 d后 分 别 比 对 照 降 低 了13.49%、13.19%、22.23%、9.88%,且 接 菌 处 理120d和180d的差异极显着，接菌处理150d和210d的差异显着。

　　RSD对 甘 蔗 气 孔 导 度 的 影 响，在GT11和Badila上 均 表 现 为 接 菌 处 理 低 于 对 照 处 理 的。

　　GT11接菌处理在120、150、180、210d分别比对照降低了15.21%、38.72%、40.58%、31.99%,在120d时差异显着，且后3个时期差异均极显着。

　　Badila接菌处理在各时期均低于对照，在120d和180d时分别降低32.72%和35.24%,且差异极显着；在150d和210d时降低虽不显着，但也分别降低了13.41%和18.21%.

　　GT11接菌处理的胞间CO2除120d外，其余各时期均低于对照，在150d和180d时差异极显着，到210d时 差 异 不 显 着，但 低 于 对 照13.53%.

　　Badila接菌处理在各时期均低于对照，但只在120d时差异极显着，其余各时期差异均不显着。

　　在蒸腾速率方面，GT11接菌处理各时期均低于对照，且差异均极显着。

　　Badila接菌处理在各时期也都低于对照，除在150d时差异不显着外，其余时期均达显着水平。这表明GT11和Badila接菌处理的净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率在各时期均低于对照处理。

　　3讨论

　　RSD病原菌体外培养不容易成功，是因为其自身缺失编码L-半胱氨酸和甲硫氨酸等关键基因[12],而且生长期间需要极其丰富的营养成分，这与其基因组内含有大量的假基因有关。

　　Lxx基因组内有310个假基因，占全部基因的11.6%[6],且该菌生长十分缓慢，生长周期长，一般需4周左右[2],因此，与其他菌竞争力很弱，一旦分离培养成功即可得到纯菌落。本试验在培养15~20d后有菌落长出，可能是因为改良后的培养基更适于Lxx的生长，或因寄主甘蔗来自于不同品种且生长环境不同。来源于同品种不同植株的原蔗汁接种时，有时菌落数很少，可能与蔗株本身带菌量很少有关。

　　本试验获得的菌落与Davis等[2]和陈健文等[13]描述 的 一 致，但 在 菌 体 形 态 上 略 有 不 同。

　　Davis等[2]、Kao等[14-15]和Liao等[12]在观察RSD病原菌形态时，发现其有分支细丝存在，但本试验中无论是菌体纯培养物观察还是蔗茎超微结构观察时，均没发现Lxx有分支细丝。这可能是试验甘蔗品种不同及其所生长的环境不同所致，或可能是不同的生理 小 种 所 致。

　　Leifsonia xyli subsp.cynodontis（Lxc）是一种引起狗牙根草丛枝、矮化症状的病原菌，Lxx与其在形态学和超微结构上不能区分，但可根据菌落差异进行区分。

　　Lxc菌落黄色，直径可达0.5~1.0mm,比Lxx菌落大许多，也是圆形、边缘整齐，也能在SC培养基上生长，且比Lxx容易培养，生长速度更快[2,16-17].本试验得到的菌落是从甘蔗体内分离且是无色的，故可断定不是Lxc.本试验还观察到RSD病原菌寄居在甘蔗木质部导管中，菌体填充着纹孔，感病蔗茎木质部导管纹孔中及壁上都粘附着许多圆形颗粒状物质。随着甘蔗的不断生长，菌体及圆形颗粒状物质不断增多，势必会因大量的菌体或菌体分泌物填充在导管内，而使甘蔗对水分和无机盐的运输能力降低，阻碍甘蔗的生长，导致其出现矮化症状。

　　陈明辉等[8]观察RSD病原菌侵染甘蔗后发现株高下降，茎径变小、节间变短，感病叶片的叶绿体变形、基粒结构消失，叶绿体外膜和内膜剥离，推测其叶片的光合作用下降。本试验中GT11和Badila感染RSD后，Pn、Gs、Ci和Tr均低于健康蔗株，证实了陈明辉等[9]的推测，并可推断感病甘蔗光合能力下降主要是由非气孔因素引起的。于力等[17]在研究黄花曲叶病毒对番茄叶片光合特性的影响时也发现光合作用光反应场所受到破坏，净光合速率下降。

　　Zhao等[18]观察甘蔗锈病侵染甘蔗后也发现叶片Pn、Gs和Tr均有所下降，其原因由非气孔因素引起。本试验中发现感病蔗茎受病原菌和圆形颗粒状物质堵塞，说明蔗株的生长不良也有可能影响气孔的发育，进而使光合作用降低。改良的MSC培养基适用于RSD病原菌的分离培养，感染RSD蔗茎木质部导管被病原菌和圆形颗粒状物质堵塞，且RSD可降低甘蔗的光合作用。

　　参考文献

　　[1] 张荣跃，黄应昆，李文凤，等。甘蔗主栽品种宿根矮化病调查及病原检测[J].中国糖料，2014（2）：26-27.

　　[2]DAVIS M J,GILLASPIA A G,HARRIS R W,et al.Ratoonstunting disease of sugarcane:isolation of the causal bacterium[J].Science,1980,210:1365-1367.

　　[3]EVTUSHENKO L,DOROFEEVA L,SUBBOTIN J,et al.Le-ifsonia poae,gen.nov.,sp.nov.,isolated from nematode gallson Poa annua,and reclassification of Corynebacterium aquatic-um Leifson 1962as Leifsonia aquatic（ex Leifson 1962）gen.nov.,nom.rev.,comb.nov.and Clavibacter xyli Davis et al.1984with two subspecies as Leifsonia xyli（Davis et al.1984）gen.nov.,comb.nov[J].International Journal of Systematicand Evolutional Microbiology,2000,50:371-380.

　　[4] 陈明辉，杨丽涛，谢晓娜，等。甘蔗宿根矮化病研究进展[J].南方农业学报，2011,42（3）：280-283.

转载请注明来自：http://www.zazhifabiao.com/lunwen/nykx/zwbh/32843.html