时间：2015-12-20 17:10:49 所属分类：基础医学 浏览量:
内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化左旋精氨酸产生的一氧化氮(NO)有扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集等作用，可调节血管张力、维持血管稳态，对心血管系统具有多重保护作用，是临床评定内皮功能的重要指标。 高脂血症可降低常氧环境机体 NO 的生成与
内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化左旋精氨酸产生的一氧化氮(NO)有扩张血管、抑制平滑肌细胞增殖和抑制血小板聚集等作用，可调节血管张力、维持血管稳态，对心血管系统具有多重保护作用，是临床评定内皮功能的重要指标。 高脂血症可降低常氧环境机体 NO 的生成与生物利用度，减弱其对血管的保护作用，引起内皮损伤，平滑肌细胞增殖，启动心血管疾病的发生与发展。
高脂血症对低氧环境人群主动脉存在怎样的影响尚不明确。本研究通过观察 SD 大鼠主动脉病理形态变化、 检测主动脉 eNOS 蛋白表达及血浆硝酸盐/亚硝酸盐(NOx)含量(间接反映 NO 含量)，探讨高脂饮食对模拟低氧环境机体主动脉的影响及其机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 实验动物 2012 年 9 月 22 日—10 月 26 日，将 20 只体重180～200 g 的 6 周 龄清洁级 Sprague-Dawley (SD)大鼠(雄 性 ，中国药科大学提供)随机分为两组：低氧(H)组与低氧联合高脂饮食(H+HFD)组，每组 10 只，于低压氧舱模拟海拔 5000 m。 H+HFD 组 大鼠灌服脂肪乳剂，10 mL/kg/d，1 次/d；H 组大鼠灌服等体积生理盐水，普通饮食。 于 4 周末抽取大鼠静脉血，置于抗凝管，并留取主动脉标本于-80℃冰箱保存。
1.1.2 脂肪乳剂 采用前期研究的方法制备脂肪乳剂。
1.1.3 主 要仪器和试剂 冷冻离心机 、DU800 核 酸蛋白仪 ( 德 国BECKMAN)，低 压氧舱室 (贵 州风雷航空机械有限公司 )， 丙 二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及一氧化氮(NO)试剂盒由南京建成生物公司提供，血脂检测试剂盒、BCA 蛋白分析试剂盒、eNOS 及β-actin 一抗、二抗分别由北京利德曼生化股份有限公司、Pierce Chem-ical Company、Abcam 公司、Santa Cruz Biotechnology lnc 提供。
1.2 方法
1.2.1 主动脉病理形态观察 取主动脉标本固定，脱水，包埋，切片，HE 染色，观察病理形态改变。
1.2.2 血浆 SOD 活力和 MDA 含量测定 于 3000 r/min 离 心抗凝血（10 min），分离血浆。 用 WST-1 法、TBA 比色法分别检测血浆SOD活力及 MDA 含量。
1.2.3 血 脂水平检测 采用直接测定法检测血浆高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量，采用终点法检测血浆总胆固醇(TCH)及甘油三酯(TG)含量。
1.2.4 血浆 NOX 水平检测 采用硝酸还原酶法检测血浆 NOX 水平。
1.2.5 主 动脉 eNOS 蛋 白水平检测 将主动脉切成小块 ， 裂解组织，匀浆，离心，取上清，检测样品总蛋白浓度。 用 5×蛋白上样缓冲液于 100 ℃变性 5 min。采用 12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白。使用半干转印槽将蛋白转印至 PVDF 膜上。 用 5%脱脂奶粉在室温下封闭 2 h，然后加兔抗 eNOS (1:250)，β-actin (1:1000)，4℃孵育过夜。
于洗膜后用辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1:6000)室温孵育 2 h，使用 ECL 液发光显影。胶片扫描后用 ImageJ 软件分析，计算目的与内参条带积分光密度值的相对比值。1.3 统计学方法应用 SPSS 17.0 统计软件包，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用 t 检验，检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 主动脉病理形态变化
H 组 内皮细胞肿胀 ，核变圆 ，局部内膜脱落 ，平滑肌细胞增生，细胞核变椭圆，局部胞浆疏松，细胞轻度排列紊乱；H+HFD 组局部内膜大片脱落，内皮细胞肿胀，平滑肌细胞明显增生，细胞核变圆，胞浆空泡变明显，细胞排列紊乱，见图 1。 2.2 血脂水平检测
H+HFD 组 LDL、TCH 含量明显高于 H 组，两组间的 TG 与 HDL水平无明显差异，见表 1。【表1】
2.3 血浆 MDA 含量与 SOD 活力的测定
H+HFD 组 MDA 含量与 SOD 活力均明显低于 H 组，见表 2。
2.4 血浆 NOx 水平测定
H+HFD 组大鼠血浆 NOx 含量低于 H 组，见表 2。
2.5 主动脉 eNOS 蛋白表达水平测定
H 组(0.82±0.15)与 H+HFD 组(0.91±0.17)大鼠主动脉 eNOS 蛋白表达水平无明显差异(t=-0.885, P=0.402)。【表2】
3 讨论
本研究通过观察 SD 大鼠主动脉病理形态变化、检测主动脉eNOS 蛋白表达及血浆 NOx 含量，探讨高脂饮食对模拟低氧环境机体主动脉的影响及其机制。结果显示，相对于低氧组，低氧联合高脂饮食组主动脉病理损伤加重，eNOS 蛋白表达水平无明显变化，而血浆 NOx 含量明显降低，血浆 TCH 及 LDL 明显升高；低氧联合高脂饮食组血浆 SOD 活力低于低氧组， 表明高脂饮食可加重模拟低氧环境大鼠主动脉的损伤。
NO 是 高原适应与习服的重要指标之一 ，高原世居藏族循环血 NO 代谢产物高于低海拔人群的水平，可增加血流灌注及氧传递，以抵消低氧影响，而机体 NO 含量降低则可引起高原适应不良。 本 研究中低氧联合高脂饮食组血浆 NOx 含 量明显低于低氧组，与文献报道一致，即 高脂饮食可使模拟低氧环境 SD 大 鼠血浆 NO 含量降低，减弱了其对血管的保护作用，加重了血管内皮的损伤，导致内膜大片脱落，平滑肌细胞明显增生，细胞核变圆，胞浆空泡变，细胞排列紊乱。 另外，血浆 NO 含量降低还可影响血管内皮细胞功能，使其释放扩血管物质减少，缩血管物质增多，进而加重了血管收缩与重构。 提 示对于慢性重度低氧性疾病的患者，高脂血症可能是其动脉损伤加重的独立危险因素。
本研究中，低氧联合高脂饮食组大鼠血浆 LDL 与 TCH 浓度明显高于低氧组，血脂异常可诱导小窝蛋白，降低 eNOS 从质膜上解离，降低 eNOS 的酶活性，即 eNOS 蛋白表达不降低而 NO 产生减少原因之一。同时，血脂异常还可引起机体抗氧化能力降低，即抗氧化指标 SOD 活力降低。 减弱其清除机体代谢过程中产生过氧化物的能力，引起 eNOS 出现无用的代偿性改变，致使 eNOS 脱偶联，减少 NO 生成，增加 NO 清除，降低其生物利用度。 既往研究亦证实抗氧化能力不足致血管内皮损伤及内皮源性 NO 生成减少，补充抗氧化剂可纠正血管内皮损伤。
综上所述，本研究结果表明与单纯低氧相比，联合高脂饮食降低大鼠抗氧化能力，降低血浆 NOx 水平，加重了主动脉损伤。
提示长期高脂饮食可能是慢性重度低氧环境机体主动脉损伤的独立危险因素，其主要原因可能是抗氧化能力降低，应积极干预和治疗。但也有研究认为联合高脂饮食并未加重低氧环境大鼠血管损伤，分析原因可能与低氧的方式、程度及时间不同有关，需进一步研究证实。 因 大鼠与人体间存在差异 ，高脂饮食对慢性重度低氧环境人主动脉的影响不能由本研究结果完全反映，有待进一步的研究。
[参 考文献] [1] 朱 明珠,金 红芳.一 氧化氮的血管调节研究进展[J].国 际儿科学杂志 ，2013,40(6):561-564. [2] 蔡 辉,赵 凌杰,赵 智明,等.高 脂血症对大鼠主动脉内皮细胞 Bax、Bcl-2蛋白表达的影响[J].微循环学杂志，2011,21(4):1-3. [3] 赵艳霞,张广梅,赵 协慧,等. 高脂饮食对模拟低氧环境 SD 大鼠肺组织eNOS/NO 的影响[J].青海医学院学报，2014,35(1):8-12. [4] 王秀娟,杨舒黎,李帅,等. 一氧化氮在动物低氧适应中的生理和分子机制[J].中国畜牧兽医，2011,38(5):62-65. [5] 赵志鹏,史旭刚,康 龙丽.一 氧化氮在高海拔适应中的作用[J].国 外医学医学地理分册，2013,34(3):206-210.
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