时间：2015-12-20 17:12:55 所属分类：基础医学 浏览量:
甲醛对人类健康的威胁已经成为人们最担忧的问题之一． 随着工业化程度的提高，环境污染也越来越严重，室内外空气中包括甲醛在内的有害物质对人类健康的威胁也日益受到重视． 甲醛生产工艺简单，价格低廉，在工业上用途很广泛，常作为防腐剂、固定剂、粘合剂
甲醛对人类健康的威胁已经成为人们最担忧的问题之一． 随着工业化程度的提高，环境污染也越来越严重，室内外空气中包括甲醛在内的有害物质对人类健康的威胁也日益受到重视． 甲醛生产工艺简单，价格低廉，在工业上用途很广泛，常作为防腐剂、固定剂、粘合剂等用于工业生产． 室内装修的板材和油漆中也含有甲醛，成为居室空气污染的主要来源． 室外环境中的甲醛主要来自汽车排放的尾气、化工产品以及工业气体排放．这些日益增多的室内外环境问题是影响人类健康的主要因素． 我国是肝癌(HCC) 发病率较高的国家之一，近20 年来肝癌的病死率呈上升趋势，已成为我国第 2 位恶性肿瘤． 肝纤维化是慢性肝损伤后炎症导致肝脏内纤维结缔组织异常沉积的病理过程，并进一步发展为肝癌． 肝纤维化是一个独立的疾病，它是许多肝脏疾病的中间发展环节． 而环境因素诱发肝病的报道也有不少，本研究试图用甲醛腹腔注射的方法模拟环境甲醛的毒性，并辅之以低浓度的甲醛饮水，观察小鼠行为变化，测量体重的增长情况，并通过石蜡切片观察小鼠肝细胞的病理性变化，探讨甲醛对小鼠的肝脏组织及细胞的毒性作用．
1、 材料与方法
1． 1 实验材料
1． 1． 1 实验动物
取雄性昆明小鼠 16 只(购于第四军医大学实验动物中心) ，体重 20 ～30 g． 实验期间小鼠自由饮水、进食．
1． 1． 2 主要试剂
15% 的甲醛溶液、10% 福尔马林溶液、乙醇溶液、无水乙醇、盐酸乙醇、伊红、苏木精、蛋白甘油、二甲苯、石蜡、中性树胶等．
1． 1． 3 实验仪器
超净工作台、解剖工具 1 套、恒温水浴箱、电子天平、染缸、切片机、烤片机、光学显微镜(OLYMPUSBX50) 、照相机(Canon powershot A650 IS) ．
1． 2 实验方法
1． 2． 1 实验分组
实验前饲养小鼠 1 周，无不良反应，饮食饮水正常者纳入实验． 随机将小鼠分为实验组(12 只) 和对照组(4 只) ．
1． 2． 2 试验方法
在无菌条件下，实验组小鼠腹腔注射纯净水配成的 15% 的甲醛溶液． 每星期周一和周四上午 10∶ 00注射 1 次，注射量为 1 mL/kg． 同时每天用 1%的甲醛溶液喂养小鼠，观察小鼠行为变化． 在甲醛处理后第3、6、8 周，分别处死实验组小鼠各 4 只． 对照组小鼠在第 6、8 周分别处死 2 只．
1． 2． 3 行为观察
每日观察并记录小鼠的食量、外观体征及行为活动等变化．
1． 2． 4 肝组织的形态及病理学观察
(1) 肝组织形态的肉眼观察
将小鼠脱臼处死，打开腹腔，取出肝脏组织，用生理盐水反复冲洗后，观察其形态、颜色等变化．(2) 小鼠肝脏组织石蜡切片的制作。取新鲜肝脏组织，用生理盐水反复冲洗后，置于 10% 福尔马林溶液中固定过夜，常规脱水石蜡包埋，制作切片，切片厚 7 μm，苏木精—伊红(HE) 染色，光学显微镜下观察组织形态特征的变化．
1． 3 统计分析
数据用 4 个独立样本的均数 ± 标准差来表示 (x ± s) ，用 F 检验来分析不同组之间的差异显著性，显著性水平定为 P ＜0． 05． 所有结果通过 SPSS 统计学软件来完成．
2、 结果
2． 1 小鼠行为及体重变化
注射甲醛后，实验组小鼠表现为群聚、少动，随后又恢复了正常的饮食等活动． 与对照组对比，发现实验组小鼠毛色发黄蓬乱． 分别在实验初始和第 3、6、8 周称量小鼠体重并取其平均值，结果显示小鼠的体重均呈增长趋势，且与对照组小鼠体重比较，实验组小鼠体重增长趋势缓慢(如图 1) ． 比较小鼠第 8 周与初始体重，得到实验组小鼠平均体重增加了 4． 80 g，对照组小鼠平均体重增加了 8． 62 g．
2． 2 肝组织的形态及病理学观察
2． 2． 1 肉眼观察
对照组小鼠肝脏表面光滑脆弱，颜色鲜红，富有光泽，皮下脂肪白而亮，没有任何病理性变化． 而实验组小鼠中，第 3、6 周肝脏表面变化不明显，相比之下，第 8 周小鼠肝脏颜色暗淡发黄，表面粗糙并出现深色斑点，边缘锐利．
2． 2． 2 光镜观察
光学显微镜下观察，对照组小鼠肝脏组织细胞形态正常，无任何病理变化，而实验性小鼠肝脏组织中 Disse 间隙增大，组织有不同程度的松散，HSC 数目增多，并不同程度地活化为肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB) ． 在第 3 周处死的小鼠肝细胞中，有少数的细胞核裂解，HSC 数量稍有增多;在第6 周处死的小鼠肝脏组织中，可见多数细胞核裂解和形变，HSC 数量明显增加; 在第8 周处死的小鼠肝脏细胞中，绝大多数肝细胞核裂解，细胞明显形变，分布于肝血窦的 Disse 道内肌成纤维细胞非常多 ．
3、 讨论
3． 1 小鼠行为变化
甲醛注射后，小鼠大都表现出群聚、安静、懒惰，随后又表现正常． 实验组小鼠毛色发黄蓬乱，体重增加缓慢． 因为肝损伤除了发生肝细胞变性、坏死、周围纤维组织和再生细胞增生等主要病理改变外，还存在着变性细胞排泄功能下降，肝内胆汁淤积及新生肝细胞、胆小管功能不全等表现，同时肝功能受损，消化吸收能力降低，且随着实验时间的延长，小鼠病变加重．
3． 2 肝组织的形态及病理学观察
对照组小鼠肝脏组织颜色鲜艳，表面光滑并富有光泽． 肝细胞多为单核，肝小叶结构清晰，肝板呈条索状，围绕中央静脉呈放射状排列，血窦内皮细胞(endothelial cell) 与肝细胞(hepatocyte) 之间有狭窄间隙，即窦周间隙或 Disse 间隙，是肝细胞与血液之间进行物质交换的场所． 第 3 周的小鼠肝脏标本看不到明显的病变，但在石蜡切片中可观察到肝脏组织变得松散，Disse 间隙增大，HSC 较对照组切片(图3A)明显增多． 第 8 周小鼠肝脏标本出现明显病变，表面明显粗糙不平，颜色暗淡，还出现深色斑点，在石蜡切片中可观察到肝脏肌成纤维细胞样细胞数目增多． 因为在毒性物质持续作用使肝脏受损时，HSC被激活并转化为肌成纤维细胞样细胞，并产生大量的胶原纤维，使基质中的胶原纤维大量沉积，从而促进肝纤维化的发生及进展，这是肝纤维化发生发展的核心环节． HSC 通过自分泌作用不断刺激自身分裂增殖并大量合成和分泌胶原等各种细胞外基质，同时，还可通过旁分泌作用激活其他尚处于“静止”状态的HSC． HSC 又称 Ito 细胞、储脂细胞、窦周细胞等，位于窦周 Disse 间隙和肝细胞间窝内，胞质富含类维生素 A 脂滴，HSC 是肝纤维化时细胞外基质的最主要来源细胞，其活化是肝纤维化发生的关键和中心． 随着诱导时间的延长，HSC 不同程度地增多，说明甲醛诱导的小鼠肝脏逐渐发生了损伤病变及纤维化．在以往的研究中多用 CCl4诱导建立动物肝纤维化模型，笔者利用甲醛诱导小鼠肝病变及其肝纤维化，初步说明甲醛也容易造成肝脏损伤． 且用低浓度的甲醛溶于小鼠的日常饮水中，引发的小鼠肝脏病变接近自然发生过程，避免了在灌胃过程中的操作对小鼠造成的机械损伤，这种肝脏损伤模型的建立也为肝病研究提供了一定的实验动物模型基础．
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