时间：2015-12-20 17:15:51 所属分类：基础医学 浏览量:
非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)包括了肝脏损伤的一个广泛的疾病谱。从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)，随后可进展为肝硬化和终末期肝
非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)包括了肝脏损伤的一个广泛的疾病谱。从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)，随后可进展为肝硬化和终末期肝病。其中NASH作为NAFLD中的关键阶段，研究其发病机制对NAFLD的治疗起着相当重要的作用。 现已有研究证实NAFLD中甘油三酯和游离脂肪酸的代谢失调机制，但胆固醇在炎症状态下参与“第二次打击”，形成NAFLD的机制仍不清楚。本实验利用四氯化碳(carbontetrachloride，CCl4)的趋肝毒性使小鼠肝细胞发生内质网应激，使固醇调节元件结合蛋白(sterolregulatorybindingproteins，SＲEBPs)表达增加，导致肝细胞内脂质集聚，出现肝细胞的脂肪变性，实现“第一次打击”，再用酪蛋白诱发慢性低丰度炎症的产生，探讨炎症因子作为一个独立的危险因素在肝细胞脂肪变性的基础上发挥“第二次打击”形成脂肪肝的分子机制。 1 材料与方法 1．1 实验动物 6～8周龄C57BL/6J雄性小鼠(购自重庆医科大学实验动物中心)12只，体质量20～26g，许可证号:SCXK2012-0001，重庆医科大学实验动物中心SPF室饲养。采用随机数字表法将小鼠分为2组。对照组(n=6):隔天皮下注射质量分数40%的CCl4-植物油溶液(0．3mL/100g)2周后，再隔天皮下注射生理盐水0．5mL16周;炎症组(n=6):隔天皮下注射质量分数40%的CCl4-植物油溶液(0．3mL/100g)2周后，再隔天皮下注射10%酪蛋白(casein)0．5mL16周。实验结束后，留取小鼠血清和肝脏组织，－80℃保存。 1．2 血清中炎症因子测定 淀粉样蛋白(serumamyloidA，SAA)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)的浓度使用ELISA试剂盒检测(分别购自美国Ｒ＆D公司及欣博盛生物科技有限公司)。 1．3 血清脂质含量测定 小鼠血清中总胆固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol，LDL-c)和高密度脂蛋白胆固醇(high-densitylipoproteincholesterol，HDL-c)浓度采用酶偶联比色法检测(试剂盒购自重庆百杰生物技术公司)。 1．4 肝脏HE染色及油红O染色 取部分新鲜肝组织用4%多聚甲醛固定，分别制作石蜡切片及冰冻切片。石蜡切片用二甲苯脱蜡后梯度酒精脱水，苏木精染色8min，蒸馏水冲洗多余染液，伊红染色2min，95%酒精脱水5min，二甲苯透明5min，中性树胶封片。冰冻切片用10%福尔马林盐溶液固定30min，1，2-丙二醇孵育2min后，油红O(Sigma公司)染色10～15min，苏木精复染1min，流水冲洗返蓝10min，甘油封片。再分别在显微镜下观察肝组织脂肪病变程度。 1．5 实时荧光定量 PCＲ采用Trizol法提取肝组织总ＲNA，用DEPC水稀释后测定浓度及D(260)/D(280)值(正常值为1．8～2．0)，标化到相同浓度。按照逆转录试剂盒(TaKaＲa)操作说明将总ＲNA逆转录成cDNA。采用SYBＲGreen荧光定量ＲT-PCＲ检测肝组织的低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor，LDLr)、固醇调节元件结合蛋白-2(sterolregulatoryelementbindingprotein2，SＲEBP-2)、SＲEBP裂解激活蛋白(SＲEBPcleavageactivatingprotein，SCAP)的mＲNACt值，引物序列见表1。取2μL逆转录产物进行实时荧光定量PCＲ，以β-actin作为内参照，反应体系为20μL。扩增条件:95℃30s预变性，95℃5s，58℃30s，70℃1min，共40个循环。采用相对定量ΔΔCt计算2组小鼠基因表达的差异，计算公式如下:实验组相对于对照组基因表达水平的倍数=－exp(ΔΔCt)，其中ΔΔCt=实验组ΔCt－对照组ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值－内参基因Ct值。 1．6 免疫组织 化学染色肝组织固定后石蜡包埋切片，兔抗LDLr一抗(1∶200，北京博奥森)，兔抗SＲEBP-2一抗(1∶300，北京博奥森)，兔抗SCAP一抗(1∶250，北京博奥森)4℃孵育过夜，用即用型免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)进行染色，具体步骤详见说明书。DAB染色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察照相，肝细胞中棕黄色颗粒分布为阳性表达。 1．7 Westernblot检测 蛋白表达按蛋白提取试剂盒说明提取小鼠肝组织总蛋白，用BCA法进行蛋白定量并标化，每孔蛋白上样量为80～100μg，β-actin作为内参照蛋白。样品加变性缓冲液煮沸10min。SDS-PAGE凝胶电泳，然后转至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2h，分别加入一抗SＲEBP-2(1∶500，北京博奥森)、一抗LDLr(1∶200，北京博奥森)，一抗SCAP(1∶500，北京博奥森)，一抗β-actin(1∶5000，北京中杉金桥)，4℃过夜孵育，TBST漂洗10min×3次，加入辣根过氧化物酶(HＲP)标记的二抗(联科生物技术有限公司)，37℃孵育2h，TBST漂洗10min×3次，ECL光化学法进行显色。 1．8 统计学分析 采用SPSS17．0统计软件，所有结果以x珋±s表示，2组间结果行独立样本t检验。 2 结果 2．1 炎症因子检测结果 炎症组的SAA［(236．09±38．45)ng/mL］和TNF-α［(82.59±11．48)pg/mL］明显高于对照组［分别为(35．68±11．34)ng/mL，(17．91±2．77)pg/mL，P＜0．05］。 2．2 血清脂质水平检测结果 炎症组的HDL-c［(0．91±0．10)mmol/L］、LDL-c［(2．65±0．44)mmol/L］、TC［(3．69±0．26)mmol/L］的血清浓度相对于对照组明显降低［分别为(1．80±0．12)、(5．76±0．33)、(4．16±0.22)mmol/L，P＜0．05］。 2．3 肝脏HE染色结果 由图1可以看出，对照组肝细胞的细胞核清晰，索状排列，呈放射状分布在中央静脉周围。炎症组肝索结构破坏，肝细胞排列紊乱，可见大量脂滴空泡和炎症细胞浸润。每组取3个肝组织切片，每张切片取3个典型视野，根据NAFLD活动度(NAFLDactivityscore，NAS)评分，对照组评分＜3分，为正常肝细胞形态，而炎症组NAS评分＞4分，可诊断为NASH。 2．4 小鼠肝细胞油红O染色结果 图2显示对照组可见点或片状红染颗粒，炎症组可见大量红染颗粒积聚成片，提示炎症可加重CCl4处理后脂肪变性肝细胞的脂质集聚。 2．5 小鼠肝组织LDLr、SＲEBP-2、SCAP的mＲNA表达实时荧光定量PCＲ检测结果显示，炎症组相对于对照组的LDLr、SＲEBP-2、SCAP基因的表达明显升高(P＜0．05，图3)。 2．6 肝组织免疫组化染色结果 SＲEBP-2、SCAP蛋白表达于肝细胞的胞质中，LDLr蛋白表达于肝细胞的胞膜与胞质。抗原阳性表达为棕黄色颗粒样着色。从图4可看出，炎症组的LDLr、SＲEBP-2、SCAP的表达比对照组增多。 2．7 Westernblot检测结果 Westernblot检测结果显示，与对照组相比，炎症组LDLr、SＲEBP-2、SCAP蛋白表达明显增高，与mＲNA检测结果相符(图5)。 3 讨论 NASH作为NAFLD发展的一个关键点，其发病机制复杂，目前被人们所接受的是“二次打击学说”。近年来关于NAFLD甘油三酯和游离脂肪酸的代谢失调机制已有大量报道，但关于胆固醇的代谢失调机制研究较少。 现有的研究发现，机体维持胆固醇稳态平衡的代谢过程由以下3个方面进行调控:通过LDLr摄取适量胆固醇，并通过3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeAreductase，HMGCＲ)调节胆固醇的内源性合成，而过多的胆固醇则通过三磷酸腺苷结合盒转运体A1、G1转到细胞之外。其中机体通过LDLr摄入血浆胆固醇是细胞内胆固醇的主要来源。本研究通过动物体内实验证明肝细胞经“二次打击”形成严重脂肪肝的胆固醇代谢失调机制。采用CCl4激发肝细胞膜脂质过氧化反应，引发内质网应激，内质网应激时，胆固醇被消耗，从而激活SＲEBPs，它与SCAP结合形成复合物从内质网转移到高尔基体，在两个蛋白酶(S1P、S2P)的作用下，SＲEBPs被裂解，其具有转录活性的N-末端片段进入细胞核内，促进LDLr基因及其他生脂相关酶等靶基因的诱导表达，增加肝细胞胆固醇的集聚，破坏正常的LDLr-SCAP-SＲEBP-2反馈调节，即“第一次打击”;再进行酪蛋白皮下注射，使单纯性脂肪变性的小鼠处于持续性低丰度炎症状态，引起细胞表面的脂蛋白受体失调，细胞通过LDLr异常大量地摄取血液循环中的胆固醇，胆固醇逆转运减少，导致肝细胞内胆固醇大量集聚，实现对肝细胞的“第二次打击”，使肝细胞由单纯性脂肪变性转化为严重的脂肪肝。 本研究中C57BL/6J小鼠经2周CCl4注射后再经16周的酪蛋白注射处理，炎症组的SAA及TNF-α浓度比对照组明显升高(P＜0．05)，说明小鼠慢性系统性炎症模型构建成功。HE染色及油红O染色中，炎症组可见大量的脂肪空泡及红染颗粒，提示炎症可促进小鼠肝细胞中的脂质集聚。炎症组小鼠血清中的HDL-c、LDL-c、TC含量较对照组明显降低(P＜0．05)，说明炎症可促进肝细胞通过LDLr异常大量地摄取血液中的胆固醇酯，促进肝细胞内的脂质集聚。ＲT-PCＲ检测结果显示炎症组的LDLr、SCAP、SＲEBP-2的mＲNA表达较对照组分别升高了1．87、5．24、2．39倍，且免疫组化及Westernblot都可看出炎症组这3种基因的蛋白表达较对照组明显升高，与基因表达趋势一致，结果表明炎症因子可能通过促进LDLr-SＲEBP-2-SCAP的表达加强肝细胞胆固醇的异常摄入，导致肝细胞脂质的异常集聚。 综上所述，本研究将CCl4导致的肝细胞脂肪变性与控制脂质代谢的SＲEBPs联系起来，通过体内实验证实了炎症微环境对CCl4导致的单纯性脂肪变进行了“第二次打击”，干扰SCAP-SＲEBP2-LDLr的正常反馈调节，促使肝细胞异常大量地摄取胆固醇，阐述炎症因子在脂肪肝形成过程中的重要作用，为脂肪肝抗炎治疗的必要性提供理论依据，同时也为NAFLD治疗的新药开发提供线索途径，但NAFLD胆固醇酯异常集聚的机制复杂，对引起其代谢失衡的其他通路还有待进一步研究。转载请注明来自：http://www.zazhifabiao.com/lunwen/yyws/jcyx/20523.html
