时间：2015-12-20 17:15:58 所属分类：基础医学 浏览量:
阿尔茨海默病（ Alzheimers disease,AD） 是一种多发于老年人，病理改变主要发生在大脑皮质和海马，以 淀粉样蛋白（ -amyloid peptide,A） 沉积形成老年斑、神经原纤维缠结（ neurofibrillary tangles,NFT） 、神经元丢失为主要病理特征。目前普遍认同AD 的
阿尔茨海默病（ Alzheimer's disease,AD） 是一种多发于老年人，病理改变主要发生在大脑皮质和海马，以 β 淀粉样蛋白（ β-amyloid peptide,Aβ） 沉积形成老年斑、神经原纤维缠结（ neurofibrillary tangles,NFT） 、神经元丢失为主要病理特征。目前普遍认同AD 的主要发病机制： 具有神经毒性的 Aβ 在脑实质沉积，启动病理级联反应，形成 NFT,导致广泛的神经元丢失.Aβ 是由39 ~43 个氨基酸构成，其中，Aβ1-42 肽具有较高聚集倾向，是老年斑中最主要的淀粉样物质,而且，Aβ1-42 可能参与了突触改变、细胞凋亡以及由轻度认知功能障碍发展到 AD的进程.目前，转基因 AD 动物模型是研究 AD的一大热点，但该模型缺少衰老过程，不能完全复制人类 AD 的所有特征，而且操作技术复杂，费用昂贵，因此还不能广泛应用。该研究模拟 Aβ 沉积，将Aβ1-42 少量多次灌注于大鼠侧脑室制备 AD 模型，利用 Morris 水迷宫法观察大鼠学习记忆能力的改变，用 RT-PCR 法和 Western blot 法检测大鼠皮质Bcl-2、Caspase-3 的 mRNA 表达以及 Bcl-2 蛋白表达、Caspase-3 活性。
1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 实验动物 健康雄性 SD 大鼠 65 只，SPF级，250 ~300 g,2 ~3 月龄，由桂林医学院实验动物中心提供。
1. 1. 2 试剂 Aβ1-42 和六氟异丙醇（ 美国 Sigma公司） ; mRNA 提取试剂盒和 PCR 反应体系（ 北京艾德莱公司） ; 逆转录试剂盒和引物（ Invitrogen 公司） ;DNA Marker（ 广州东盛生物科技有限公司） ; WIP 组织裂解液（ 北京博奥森公司） ; BCA 蛋白浓度测定试剂盒（ 碧云天公司） ; 兔抗 Caspase-3（ Active） 一抗（ 上海蓝基公司） ; 兔抗 Bcl-2 一抗 （ 武汉博士德公司） ; 鼠抗 β-actin 一抗、山羊抗小鼠 IgG 二抗、山羊抗兔 IgG 二抗、ECL 发光液（ 北京中杉金桥公司） ;PageRulerTM预染蛋白梯度（ 上海麦约尔公司） ; 微量给药系统（ 深圳瑞沃德公司） ; 实验所需的仪器由桂林医学院科学实验中心和解剖教研室提供。
1. 2 方法 1. 2. 1 Aβ1-42 寡聚体和 Aβ1-42 纤维的制备 ①Aβ1-42 寡聚体制备： 将 1 mg Aβ1-42 单体溶于六氟异丙醇至浓度为 4. 5 mg/ml,室温孵育 60 min,真空冷冻蒸发六氟异丙醇后，加入二甲基亚砜至浓度为22. 5 mg / ml,超声浴处理 10 min,加入含有 0. 2%SDS 的 PBS,稀释浓度至 2. 5 mg / ml,4 ℃ 孵育 24 h后，用 PBS 稀释至终浓度 1 mg/ml,4 ℃ 孵育 2 周。② Aβ1-42 纤维的制备： Aβ1-42 溶于 PBS 中，浓度为 1 mg/ml,37 ℃ 孵育 7 d,转变为聚集态的 Aβ1-42,4 ℃ 保存。
1. 2. 2 AD 动物模型的制备 通过 Morris 水迷宫试验，将逃避潜伏期少于 60 s 的健康雄性 SD 大鼠 60只随机分成 4 组（ n = 15） : 正常组、PBS 对照组、Aβ1-42 纤维组、Aβ1-42 寡聚体组。用 10% 水合氯醛（ 300 ~350 mg/kg） 腹腔注射麻醉大鼠，头顶部备皮。将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，手术区消毒，在颅顶中间部作一纵切口，暴露颅骨，参照《大鼠脑立体定位图谱》，前囟后 0. 8 mm,中线旁开 1. 5mm,用牙科钻钻开颅骨，垂直插入微量给药导管（ 长度 3. 5 mm） ,用牙托粉和义齿基托树胶将给药导管固定于颅骨表面，缝合皮肤，肌肉注射青霉素 8万单位/只，预防感染。通过微量注射内管，每天给予 Aβ1-42 纤维或 Aβ1-42 寡聚体 5 μg,连续给药 5d.PBS 对照组采用同样的方法给予等量的 PBS,正常组不作任何处理。
1. 2. 3 Morris 水迷宫测试大鼠行为学习记忆能力的变化 Morris 水迷宫实验系统包括一不锈钢圆形水池、一可调换位置的圆形透明的有机玻璃平台，电脑以及连接电脑的摄像机。Morris 水迷宫圆形水池等分为 4 个象限，平台置于第 4 象限中央位置，平台低于水面 2 cm.在各象限中间标记入水点，将大鼠面向池壁分别从 3 个入水点（ 不包括第 4 象限入水点） 放入水中，若大鼠入水后 60 s 未能找到平台，则把大鼠从水中拖上平台，并停留 10 s,接着进行下一次训练。每组大鼠在造模前均进行水迷宫实验，从训练的第 3 天开始，记录大鼠从入水寻找并爬上平台所需要的时间（ 即逃避潜伏期） ,连续测试 5 d,每天测试 2 次，两次平均值为当天逃避潜伏期。造模结束后的第 4 周采用同样的方法对大鼠进行水迷宫实验，连续测试 5 d,每天 2 次。根据每组大鼠造模前后逃避潜伏期的长短判断各组大鼠记忆能力的变化情况。水迷宫实验环境安静，周围参照物不变，室内日光灯照明，水温 25 ℃，时间一般选在 10 ∶ 00 ~12 ∶ 00,15 ∶ 00 ~ 17 ∶ 00.
1. 2. 4 RT-PCR 法检测 AD 大鼠皮质 Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA 的表达 PCR 反应体系（ 参考 PCR说明书） : Taq Master Mix 12. 5 μl,上下游引物各 1μl（ 10 μm） ,模板 DNA 4 μg,加 DEPC 水补至 25 μl.PCR 反应条件： 预变性 94 ℃ 2 min,变性 94 ℃ 30 s、退火50 ~60 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 1 min（ 30 个循环） ,终延伸72 ℃ 5 min.Bcl-2 引物序列： 上游为5'-GC-CTTCTTTGAGTTCGGT-3',下 游 为 5'-TCAAACA-GAGGTCGCAT-3',扩增产物片段长 188 bp; Caspase-3 引 物 序 列： 上 游 为 5'-CAGAGCTGGACTGCGG-TATT-3',下 游 为 5'-CCATGACCCGTCCCTTGAAT-3',扩增产物片段长 146 bp; β-actin 引物序列： 上游为 5'-CCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3',下 游 为 5'-TCTCCATATCGTCCCAGTTGGTG-3',扩增产物片段长 299 bp.PCR 反应产物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测，用 LeicaQ5100W 型全自动图像分析仪分析电泳结果。
1. 2. 5 Western blot 检测 AD 大鼠皮质 Bcl-2 蛋白表达及 Caspase-3 活性 造模后水迷宫试验后，从各组中随机选取 5 只大鼠断头取脑，分离皮质，依照WIP 组织细胞裂解液说明书提取蛋白，用 BCA 法检测样本蛋白浓度。样品的上样体积为30 μl（ 总蛋白量为 30 μg） ,用 12% 的凝胶进行 SDS-PAGE 电泳；转膜后以 5%的脱脂奶封闭液封闭； 一抗（ 1 ∶ 300）孵育 2 h; 用 TBST 洗膜 3 次（ 10 min/次） ; 加入二抗（ 1 ∶ 6 000） 孵育 1 h; 洗膜。用 Western blot 发光试剂盒发光、显影、定影。用全自动数码成像分析系统对结果进行分析。
1. 3 统计学处理 采用 SPSS 17. 0 统计软件进行分析，数据以珋x ± s 表示，多组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2. 1 学习记忆能力的变化（ 逃避潜伏期） 造模前各组大鼠的逃避潜伏期差异无统计学意义。造模后，Aβ1-42 纤维组、Aβ1-42 寡聚体组大鼠逃避潜伏期与正常组和 PBS 对照组相比均延长（ P < 0. 05） ,以 Aβ1-42 寡聚体组变化更显着。见表 1.2. 2 皮质 Bcl-2 mRNA、Caspase-3 mRNA 表达水平 与正常组相比，Aβ1-42 纤维组、Aβ1-42 寡聚体组的 Bcl-2 mRNA 表达降低（ P <0. 05） ,而 Caspase-3 mRNA 的表达增高（ P < 0. 05） ; 与 Aβ1-42 纤维组比较，Aβ1-42 寡聚体组变化更明显。见图 1.【图1】 2. 3 皮质 Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达水平 Aβ1-42纤维组和 Aβ1-42 寡聚体组大鼠皮质 Bcl-2 蛋白表达比正常组低，差异有统计学意义（ P <0. 05） ,而有活性的 Caspase-3 在 Aβ1-42 纤维组和 Aβ1-42 寡聚体组表达增高（ P <0. 05） .见图 2.【图2】 3 讨论 3. 1 Aβ1-42 寡聚体神经毒性对学习记忆能力的影响 AD 患者脑内老年斑的 Aβ 主要是以纤维体的形式存在，Aβ 寡聚体是纤维体的一种过渡形式，是目前认为具有较大神经毒性的 Aβ 存在形式。Aβ对神经元有毒性作用，在体内外均可引起神经元凋亡，其异常代谢将会导致各种病理改变，在 AD 发生和发展过程中起关键作用.
利用 Morris 水迷宫试验检测大鼠学习记忆能力的变化。大脑额叶皮质和海马在学习记忆中起着重要作用。当大脑皮质和海马病变时，其学习记忆能力会受到影响，而具有神经毒性的 Aβ 寡聚体主要沉积在皮质和海马中，从而影响学习记忆能力。本研究在造模前进行的水迷宫试验主要是观察大鼠的学习能力，而给药后再次使用水迷宫试验是对记忆的提取和再巩固，根据造模前后两次逃避潜伏期长短的变化来判断 Aβ 寡聚体对大鼠学习记忆能力的影响。从实验结果可知，造模前各组大鼠学习记忆能力无明显差异，造模 4 周后，Aβ1-42 纤维组、Aβ1-42 寡聚体组逃避潜伏期较造模前均延长，但以Aβ1-42 寡聚体组变化更显着，正常组和 PBS 对照组无明显变化，由此可知 Aβ1-42 寡聚体比 Aβ1-42 纤维毒性更大，更易损害 AD 大鼠学习记忆功能。当寡聚体 Aβ 转化成纤维化 Aβ，其神经毒性会降低。
成年动物大脑皮质神经元在正常情况下不具有分裂增殖能力，但在一定诱导条件下可分裂再 生。
Varvel et al发现在体外制备的 Aβ 寡聚体，在皮质神经元分裂的过程中可诱导 DNA 的合成，但这一过程可被特定的 Aβ 寡聚体抗体阻止，低分子量的 Aβ寡聚体可诱导 AD 模型小鼠的神经元细胞进入细胞分裂周期。
3. 2 Caspase-3 与 Aβ1-42 寡聚体的细胞毒性Caspase-3 在细胞凋亡中扮演重要角色。有研究表明 Caspase-3 首先定位于 AD 患者突触后密集区，并在这一区域表达升高，其在突触变性疾病进展过程中起重要作用。本研究检测各组 AD 大鼠皮质的Caspase-3 mRNA 的表达及 Caspase-3 活性，与正常组及 PBS 对照组比较发现，Aβ1-42 纤维组和 Aβ1-42 寡 聚 体 组 皮 质 Caspase-3 mRNA 表 达 上 调，Caspase-3 活性增高，其在 Aβ1-42 寡聚体组中变化更显着，故可知 Aβ1-42 寡聚体能诱导 Caspase-3mRNA 表达，激活 Caspase-3,更容易诱导细胞凋亡。
有活性的 Caspase-3 会引发广泛的神经元破坏和退化，但不引起神经元细胞急性死亡.
3. 3 Bcl-2 与 Caspase-3 的关系 Bcl-2 是一个抑制凋亡基因，作为 Caspase 上游调控机制，其过度表达能抑制各种因素诱发的 Caspase 激活和凋亡，可能通过抑制细胞色素 C 等从线粒体的释放调控着线粒体渗透性转换孔的开启，从而抑制 Caspase-3 活化。另外，Bcl-2 还可阻止线粒体释放 Caspase-3,并抑制其合成.Bcl-2 又是 Caspase-3 的直接底物，Bcl-2 蛋白的环区可被 Caspase-3 在 Asp34 处剪切.如果 Bcl-2 表达水平改变的同时伴随着天门冬氨酸受体的改变，可导致钙离子失衡，从而激活Caspase-3,诱导细胞凋亡.
本研究显示，与正常组和 PBS 对照组相比，Aβ1-42 纤维组及 Aβ1-42 寡聚体组皮质中 Bcl-2mRNA 及 Bcl-2 蛋白表达均降低，其中 Aβ1-42 寡聚体组的 Bcl-2 变化更明显。由此可知当 Aβ1-42 激活 Caspase 酶原后，Bcl-2 表达减少，细胞抑制凋亡的能力减弱，促凋亡的作用增强。
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