探讨降低S100A4表达对系膜细胞增殖的调控作用

时间：2015-12-20 17:23:54 所属分类：基础医学 浏览量: 222

持续的系膜增殖和系膜基质增多可导致不可逆性肾小球硬化〔1〕,抑制系膜细胞增殖是增殖性肾小球疾病重要的治疗策略。S100A4 是 S100 基因家族成员，是一种钙结合蛋白〔2〕,参与肾组织内上皮-间充质转分化过程〔3〕,其对肾小球系膜细胞增殖是否有影响尚未见报

　　持续的系膜增殖和系膜基质增多可导致不可逆性肾小球硬化〔1〕,抑制系膜细胞增殖是增殖性肾小球疾病重要的治疗策略。S100A4 是 S100 基因家族成员，是一种钙结合蛋白〔2〕,参与肾组织内上皮-间充质转分化过程〔3〕,其对肾小球系膜细胞增殖是否有影响尚未见报告。本研究通过体外培养大鼠系膜细胞，探讨降低 S100A4 表达对系膜细胞增殖的调控作用。

　　1 材料方法　　　　1. 1 实验材料 1640 细胞培养粉剂及 Tri201 试剂（ GIBCO 公司） ; MicroBCA 蛋白浓度检测试剂盒、MTT（ Sigma 公司） ; 小牛血清（ Fetal bovine serum,FCS,Hycolon 公司） ; 羊 S100A4 抗体、小鼠 p21 抗体、小鼠 cyclinD1 抗体、小鼠 CDK2 抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG、羊抗兔 IgG、脂质体 TransPass R2Transfection Reagent（ Biolab 公司） ; M-MLV 反转录酶（ Invitrogenlife technologies 公司） ; PCR 试剂 （ TaKaRa Biotechnology 公司） ;ECL 显色试剂盒（ Santa Cruz Biotechnology 公司） .

　　1. 2 大鼠肾小球系膜细胞系 RMC 的培养 雄性 Wistar 大鼠160 ~ 200 g 由吉林大学动物中心提供。无菌条件下取双侧肾脏，剥离肾包膜，肾皮质剪成碎块，放于重叠的三层不锈钢筛网上。收集第二层筛网上的组织移入离心管，V 型胶原酶（ 0. 5 mg/ml） 消化，15%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液于37℃、5% CO2条件下培养原代的系膜细胞，7 d 传代，经 Desmin（ +） 、Ⅷ（ -） 鉴定后，用于以下实验。

　　1. 3 S100A4-15siRNA 的设计与合成 根据 Genbank 中大鼠S100A4-15 mRNA 全长序列（ AB020759. 1） 设计抑制 siRNA 的靶序列： 5'-AAGCCTTCTGTTCCTGCTACA-3',经上海吉玛公司合成双链 siRNA（ siS100A4） ,正义链： 5 '-GCCUUCUGUUCCUGCUACAtt-3',反义链： 3 '-ttCGGAAGACAAGGACGAUGU-5 '.同时合成无关 siRNA 序列作为对照（ siCon） : 正义链： 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 ',反 义 链： 3 '-ttTTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 '.合成的双链 siRNA 用 DEPC 处理的水溶解至100 μmol / L,-20℃ 冻存备用。

　　1. 4 siRNA 转染 细胞长至 50% ~ 60% 左右（ 以 12 孔板为例） ,进行如下转染步骤（ NEB TransPass R2 试剂盒） : ①25 μlA 液加入 0. 6 ml 无血清 1640 培养液中，混匀。②再加入2. 5 μlB 液体，混匀。③加入终浓度为 100 nmol / L 的 siRNA（ siCon 或siS100A4） .④室温静置孵育 20 min.⑤期间待转染细胞用无血清 1640 清洗 1 遍。⑥孵育液加到细胞培养皿，37℃培养4 h.⑦细胞中加 1 ml 正常 RPMI 1640 培养液（ 含血清） .⑧过夜培养。⑨更换新鲜的培养基培养 24 h 备用。

　　1. 5 细胞增殖的检测　　1. 5. 1 MTT 法检测细胞增殖能力 大鼠系膜细胞 10 000 个 /孔接种于 96 孔板，无血清同步 16 h 后分为以下 4 组： ①无血清组； ②10%FCS 正常培养组； ③10% FCS+siCon 组； ④10% FCS+siS100A4 组，37℃ 孵育 24 ~ 48 h.在到达各时间点时弃去培养液，加入 MTT（ 终浓度 5 mg/ml） 20 μl,孵育 4 h,吸去上清，每孔加入二甲基亚砜（ DMSO） 200 μl,室温溶解15 min,分光光度计490 nm 读取 OD 值。每组设 6 个复孔，共重复 3 次。

　　1. 5. 2 流式细胞仪检测细胞周期 系膜细胞传代至25 cm2培养瓶中，无血清同步 16 h 后分组同上。培养 24 h 后收集细胞，PBS 液洗 2 次，加入 75% 乙醇固定，4℃ 过夜，次日离心后 PBS液洗 2 次，重悬于 0. 5 ml PBS 中。样品经 RNA 酶（ 50 μg/ml）处理后，碘化丙啶（ PI,50 μg/ml） 室温避光染色 30 min 后上机。应用 BD 流式细胞分析仪的 FACScan 测量 DNA 含量，细胞周期变化数据用 CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2. 0 1. 2 软件分析（ BD 公司） ,以细胞周期各时相细胞百分率记录数据并分析。每组 3 瓶，重复 3 次。

　　1. 6 Western 印迹法检测 S100A4 对细胞周期调节蛋白 p21、cyclin D1、CDK2 表达 系膜细胞传代至 25 cm2培养瓶中，转染、无血清同步 16 h 后分组同上； 培养48 h 后0. 25%胰酶消化收集细胞。Western 印迹法步骤同上： 最后分别加入小鼠 cy-clinD1 抗体（ 1 ∶100 稀释） 、小鼠 p21 抗体（ 1 ∶ 100 稀释） 、小鼠CDK2 抗体（ 1 ∶100 稀释） 、兔 β-actin 抗体（ 1 ∶1 000 稀释） ,室温孵育 4 h; TBST 洗膜 3 次，分别加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠 IgG（ 1 ∶1 000 稀释） 、羊抗兔 IgG（ 1 ∶2 000 稀释） ,室温孵育45 min; TBST 洗膜 3 次； ECL 显影。ALPHAIMAGER 2200 凝胶图像分析系统半定量分析。

　　1. 7 统计学处理 计量资料采用 x±s 表示，MTT 实验采用双因素方差分析，其余采用单因素方差分析。两两比较采用 q 检验，采用 SPSS16. 0 软件进行数据处理。

　　2 结 果　　　　2. 1 MTT 检测 S100A4 对系膜细胞增殖速率的影响 转染抑制 S100A4 的 siS100A4 后 48 h 细胞数明显低于正常对照组和无关 siRNA（ SiCon） 组（ P<0. 05） ,见表 1.【表1】

　　2. 2 S100A4 对系膜细胞周期的影响 siRNA 抑制 S100A4 组S 期细胞以及 S+G2/ M 期细胞数（ 增殖指数） 明显低于正常对照组及无关 siRNA 转染组（ P<0. 05） ,见表 2.【表2】　　　　2. 3 Western 印迹法检测周期蛋白 CDK2、cyclinD1 和 p21 的表达变化 siRNA 抑制 S100A4 48 h 后，细胞周期蛋白 CDK2和 CyclinD1 均明显低于正常对照组及无关 siRNA 转染组（ CDK2 10% FCS+siS100A4 组： 0. 61±0. 02 vs. 10% FCS 正常培养组： 0. 33±0. 01; 10%FCS+siCon 组 0. 35±0. 01 P<0. 05,n=3,CyclinD1 10% FCS+siS100A4 组： 0. 61±0. 02 vs. 10% FCS 正常培养组： 0. 51±0. 01; 10% FCS+siCon 组 0. 46±0. 01 P<0. 05,n =3） ; 同样 p21（ 10. 45 ±0. 01,P <0. 05） 也出现类似的变化趋势。见图 1.【图1】　　　　3 讨 论　　　　本结果提示 S100A4 可能是细胞增殖的正调控因子，与其在心肌和平滑肌细胞的作用研究结果类似〔3 ~5〕.细胞周期的改变必然伴随着细胞周期蛋白的变化。在人类增殖性肾炎组织中肾小球内 E2F1、cyclinD1、CDK2 等细胞周期相关调控因子的表达显着上调〔6〕.本研究结果证实抑制 S100A4 可引起促进细胞进程的相关蛋白 CyclinD1 和 CDK2 的表达水平降低。但抑制细胞周期进程的基因 p21 却同样出现了下调，该基因的表达下调，可能是细胞周期负反馈调节的代偿现象，虽然表达下调，但可能不足以抑制促进细胞周期进程的相关蛋白的作用。

　　参考文献　　　　1 Mima A,Abe H,Nagai K,et al. Activation of Src mediates PDGF-inducedSmad1 phosphorylation and contributes to the progression of glomerulo-sclerosis in glomerulonephritis〔J〕。 PLoS One,2011; 22; 6（ 3） : e17929.　　2 Garrett SC,Varney KM,Weber DJ,et al. S100A4,a mediator of metasta-sis〔J〕。 J Biol Chem,2006; 281（ 2） : 677-80.　　3 Fernandez-Fernandez MR,Veprlntsev DB,Fersht AR. Proteins of theS100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor〔J〕。Proc Natl Acad Sci USA,2005; 102（ 3） : 4735-40.　　4 Liu T,Li Y,Lin K,et al. Regulation of S100A4 expression via the JAK2-STAT3 pathway in rhomboid-phenotype pulmonary arterial smooth musclecells exposure to hypoxia〔J〕。 Int J Biochem Cell Biol,2012; 44 （ 8 ） :1337-45.　　5 Sack U,Walther W,Scudiero D,et al. Novel effect of antihelminthicNiclosamide on S100A4-mediated metastatic progression in colon cancer〔J〕。 J Natl Cancer Inst,2011; 103（ 13） : 1018-36.　　6 Xie Y,Chen X. Epidemiology,major outcomes,risk factors,preventionand management of chronic kidney disease in China〔J〕。 Am J Nephrol,2008; 28: 1-7.

婵犵數濮烽弫鍛婃叏娴兼潙鍨傞柣鐔峰簻閼板潡寮堕崼娑樺婵炲懐濮垫穱濠囧Χ閸屾矮澹曢梺鍛婎殜娴滃爼寮婚妸鈺傚亞闁稿本绋戦锟�:闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓瀹曨垶骞愭惔銏＄彿闁瑰吋鐣崹娲矗韫囨稒鐓熼柕蹇婃嚉瑜版帒绀勯柣妯肩帛閻撴洟鏌熸导瀛樻锭闁哄鍠栭弻娑氣偓锝庡亞婢ь剟鏌曢崶褍顏€殿噮鍣ｅ畷鍫曗€栭鑺ュ磳婵﹤顭峰畷鐔碱敃閵囨妸鍥ㄧ厸閻忕偠顕ч埀顒佺墱缂傛捇鎳為妷銉х獮婵犮垼娉涢張顒勫疾婵傚憡鈷掑ù锝堟鐢盯鏌熺喊鍗炰簽婵″弶鍔欏鎾偐閹颁焦缍楅梻浣告惈閸燁偊鎮ч崱娆戜笉闁挎繂妫涚粻楣冩煕閳╁喚娈欓悗姘緲闇夋繝濠傚閸斻倝妫佹径鎰叆婵犻潧妫欓幖鎰版煕閺傛鍎愬ǎ鍥э躬椤㈡稑顫濋幑鎰儓闂備礁鎼惌澶屾崲濠靛棛鏆︽い蹇撴噺婵挳鏌涘☉姗堝姛濞存粍鐗犲缁樼瑹閳ь剟鍩€椤掑倸浠滈柤娲诲灦瀹曘垽宕ㄦ繝浣虹畾闂佺粯鍔栧ḿ娆戠箔瑜忕槐鎺楊敊鐟欏嫭鐝曢梺闈涚墳缂嶄礁鐣峰鈧俊鎼佹晜缂佹﹩妫ㄩ梻鍌氬€风欢姘缚閼姐倐鍋撻棃娑氱劯鐎规洏鍨洪妶锝夊礃閵娧屽晣闂備胶枪缁绘ê螞鐠恒劍宕查柛鈩兦滄禍婊堟煙闁箑鏋涢柡瀣闇夋繝濠傚暙閳锋梻绱掓潏銊﹀鞍闁瑰嘲鎳忛ˇ鐗堟償濡粯娅冮梻鍌欑劍閹爼宕濆鍜佹富闁芥ê顦介崵鏇㈡煙閹澘袚闁稿瀚伴弻锝夊箻閾忣偅宕冲銈嗘煥椤︻垶鈥旈崘顔嘉ч柛鈩冿供濮婂潡姊虹粙娆惧剱闁告梹娲熼敐鐐测攽鐎ｎ€晠鏌嶉崫鍕偓濠氬矗閸℃せ鏀介柣鎰綑閻忥箑鐣濋敐鍛仴闁诡喚鍋ら弻銊р偓锝冨妺缁ㄥ姊洪崫鍕妞ゃ劌妫楅埢宥嗙節閸曘劌浜炬繛鍫濈仢閺嬨倕顭胯椤ㄥ﹪鐛崱娑樼睄闁割偅绻嶅ḿ濠囨⒑閺傘儲娅呴柛鐕佸亰椤㈡梹瀵肩€涙ǚ鎷绘繛杈剧到閹诧繝骞嗛崼銉︾厱濠电姴濯遍崷顓炲疾闂備線娼ц噹闁稿本绮屾晶楣冩⒒娴ｈ櫣甯涢柛鏃€娲栬灒濠电姴娲ら悿顕€鏌涘☉妯兼憼闁绘挾濮烽惀顏堝级閸喛鍩炴繝鈷€鍌氬祮闁哄矉缍佹俊鐑藉Ψ閿曗偓濞堟姊洪崫鍕拱缂佸鍨块崺銏℃償閵娿儳鐤€濡炪倖甯掗崐椋庢濮椻偓濮婄粯绗熼埀顒€岣胯铻炴俊銈呮噹閻ゎ喖霉閸忓吋缍戠紒鐘靛枛閹鈽夊▍铏灦閸掑﹦鈧潧鎽滅壕濂告倵閿濆骸骞楃痪顓℃硾闇夋繝濠傚婢у灚鎱ㄦ繝鍐┿仢妤犵偞鍔栭幆鏃堟晲閸屾侗娼旈梻鍌欑閹碱偊鎮у⿰鍫濈婵ɑ澧庨崑鎾绘濞戞牕浠悗瑙勬礃閿曘垽銆佸▎鎾村殐闁冲搫鍟悙濠傗攽閻樺灚鏆╁┑顔绢棎婢ф繈姊虹粙娆惧剱闁圭ǹ澧藉Σ鎰板箻閹颁礁鎮戦梺绯曞墲閿曗晛螞閸愵喗鈷戠痪顓炴噺閻濐亪鏌熼悷鐗堝枠鐎殿噮鍋婇獮妯肩磼濡粯顏熼梻浣芥硶閸ｏ箓骞忛敓锟�.闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓瀹曨垶宕稿Δ浣糕偓鍫曟煕椤愮姴鍔氶柣鎺戠仛閵囧嫰骞掑鍥舵М婵犫拃灞界仭缂佺粯绋撴禒锕傚磼濮橈絽浜炬繝闈涱儏閽冪喖鏌ㄥ☉妯侯仱闁稿鎹囬弫鎰償閳ヨ尙鏁栭梻浣规た閸樺ジ顢栨径鎰摕婵炴垶鍩冮崑鎾绘晲鎼存繄鏁栭柡浣哥墦閹鈻撻崹顔界亞闂佸憡顨嗘繛濠囧Υ娴ｇ硶妲堟俊顖炴敱閻庡姊洪悷閭﹀殶濠殿噮鍙冨绋库枎閹剧补鎷绘繛杈剧悼鏋柟顔藉灦缁绘繈濮€閳藉懓鈧寧顨ラ悙璇у伐妞ゆ挸銈稿畷鍫曞煛閸愵亝娈介梻鍌欑閹碱偆绮旈弻銉ョ閹兼番鍔岄悡婵嬫煛閸愩劌鈧敻宕戦幘鑽ゅ祦闁割煈鍠栨慨搴♀攽閳藉棗浜濇い銊ワ工閻ｇ兘濮€閵堝懐顔婂┑掳鍊撻懗鍫曞储閹间焦鈷戦柛鎾村絻娴滀粙鏌涚€ｎ亜顏柡鍛埣椤㈡岸鍩€椤掆偓椤繘鎼圭憴鍕瀭闂佹寧绻傚Λ娆撴偟濮樿埖鍊甸悷娆忓缁岃法绱撳鍕槮妞ゆ洩缍佸畷婊勬媴閻熸壆锛忛梻渚€娼чオ鍨繆閸モ晝鐭撻柛鎾楀懐锛濋梺绋挎湰閻熴劑顢欐径鎰厱閻庯綆鍋呭畷宀勬煛瀹€瀣М妤犵偛顑夐幃娆撳幢濡櫣浼岄梺璇″枟椤ㄥ﹪銆佸璺虹劦妞ゆ帒瀚拑鐔兼煥濠靛棙濯兼繛灏栨櫊閺岋綁骞橀崘宸妷闂佽绻愬Λ娆戞崲濞戙垺鏅查柛娑卞枟閹瑩姊洪幐搴㈠濞存粠浜幃浼搭敊閻ｅ瞼鎳濋梺閫炲苯澧寸€殿噮鍋婇獮妯肩磼濡粯顏熼梻浣芥硶閸ｏ箓骞忛敓锟�,闂傚倸鍊搁崐椋庣矆娓氣偓楠炲鏁撻悩鍐蹭画濡炪倖鐗滈崑娑㈠垂閸岀偞鐓曟い顓熷灥娴滅偞銇勯埡鍐ㄥ幋闁哄本鐩、鏇㈡偐閼碱兛鎮ｉ梺璇查閻忔岸鎮￠敓鐘茶摕闁靛ň鏅滈崑鍡涙煕鐏炲墽鈽夋い蹇ユ嫹闂傚倸鍊峰ù鍥敋瑜忛埀顒佺▓閺呯姴鐣峰Ο鑽ょ瘈婵﹩鍘搁幐鍐⒑閸涘﹥澶勯柛瀣崌閹虫捇宕稿Δ浣哄弰闂婎偄娴勭徊鑺ョ閺嶎灐鐟扳堪閸曨厾鐓€闁剧粯鐗犻弻銊モ攽閸℃ê娅ｉ梺鍝勬閸嬨倝寮婚妸銉㈡闁惧浚鍋勯锟�婵犵數濮烽弫鎼佸磻濞戙垺鍋ら柕濞у啫鐏婇悗鍏夊亾闁告洦鍓欐禍閬嶆⒑閸涘﹣绶遍柛鐘冲哺閵嗗懘寮婚妷锔惧幍闂佺粯鍨堕敃鈺佲枔閺冨倻纾奸柍褜鍓熷畷鍗炩槈濞嗘垵骞楁繝纰樻閸ㄧ敻宕戦幇顔芥殰婵炴垯鍨洪悡鐔哥節閸偅灏伴悗姘炬嫹.

转载请注明来自：http://www.zazhifabiao.com/lunwen/yyws/jcyx/20856.html