液相色谱 － 电感耦合等离子体质谱法 同时测定尿液中 6 种砷形态

时间：2019-05-22 10:39:50 所属分类：药学 浏览量: 194

摘 要:建立了 HPLC-ICP-MS 测定尿液中 6 种砷形态的方法。直接过滤或是纯水稀释后过滤处理样 品，以 20 mmol /L NH4H2PO4 ( pH 8. 0 ) 作 为 流 动 相，Hamilton PRP-X100 ( 250 mm 4. 1 mm，10 m) 阴离子交换分析柱分离砷胆碱( AsC) ，砷甜菜碱( AsB) ，As(

　　摘 要:建立了 HPLC-ICP-MS 测定尿液中 6 种砷形态的方法。直接过滤或是纯水稀释后过滤处理样 品，以 20 mmol /L NH4H2PO4 ( pH 8. 0 ) 作 为 流 动 相，Hamilton PRP-X100 ( 250 mm × 4. 1 mm，10 μm) 阴离子交换分析柱分离砷胆碱( AsC) ，砷甜菜碱( AsB) ，As( Ⅲ) ，二甲基砷 ( DMA) ，一甲基砷( MMA) 和 As( Ⅴ) ，ICP-MS 测定 6 种形态砷。在优化的测试条件下，6 种形态砷在 0. 5 ～ 100 μg /L 或 1 ～ 100 μg /L 范围内线性关系良好，相关系数均大于 0. 9998。在低、中、高 3 个加标浓度水平，6 种形态砷的回收率为 87. 0% ～ 109. 3% ，平均回收率为 89. 6% ～ 108. 0% ，RSD 为 0. 65% ～ 4. 3% 。AsC，AsB，As( Ⅲ) ，DMA，MMA 和 As( Ⅴ) 的检出限分别为 0. 4，0. 3，0. 4，0. 4，0. 3，0. 5 μg /L。方法可用于正常人尿液、砷中毒患者尿液或是接受砷剂治疗的白血病患者的尿液中砷形态的测定。

　　关键词:液相色谱 - 电感耦合等离子体质谱法; 砷形态; 尿液

　　砷的毒性与其的存在形态密切相关，在常见砷的化 合 物 中，亚 砷 酸 盐 ( As ( Ⅲ) ) 和 砷 酸 盐 ( As( Ⅴ) ) 毒性较大，一甲基砷( MMA) 和二甲基砷 ( DMA) 毒性较小，砷甜菜碱( AsB) 、砷胆碱( AsC) 和砷糖等则基本上没有毒性。砷在生物体内会发生代谢、转化、使得砷的形态变得复杂[1 - 5]，尿液是较容易获得的检材，但尿液中总砷的含量难以准确反映出人体的安全水平。所以，只以总砷作为判定砷中毒的依据不够科学、严谨; 同样，对接受砷剂治疗的白血病患者，测定其体液中砷的形态有利于更加合理用药。目前，砷形态的分析方法主要 HPLC-HGAFS [6 - 12]，HPLC-ICP-MS [10，13 - 14]，IC-ICP-MS [15]， CE-ICP-MS [16]，HPLC-HG-AAS [10] 等。其 中，ICPMS 具有高灵敏度和较宽的线性范围，被广泛的用于微量的多元素测定。本研究选取尿液作为研究对象，采用直接过滤或是纯水稀释后过滤的方法处理尿液样品，采用阴离子交 换 分 析 柱 分 离 AsC，AsB，As( Ⅲ) ，DMA， MMA 和 As( Ⅴ) 6 种形态砷，ICP-MS 标准曲线法定量测定各个形态砷的含量。本方法操作简便，可应用于接受砷剂治疗的白血病患者的尿液和其他砷中毒患者尿液中砷的形态分析。

　　1 实验部分

　　1. 1 仪器与试剂

　　Agilent 7700x ICP-MS ( 美 国 安 捷 伦 公 司) ; Agilent 1260 液相色谱仪，配有单元泵，手动进样器 ( 美国安捷伦公司) ; Hamilton PRP-X100( 250 mm × 4. 1 mm，10 μm) 阴离子交换分析柱和 Hamilton PRP-X100( 20 mm × 4. 1 mm，10μm) 阴离子交换分析保护柱( 美国 Hamilton 公司) 。砷胆碱溶液标准物质( 以 As 质量浓度计为 28. 0 μg /g) 、砷甜菜碱溶液标准物质( 以 As 质量浓度计为 38. 8 μg /g) 、亚砷酸根溶液标准物质( 以 As 质量浓度计为 75. 7 μg /g) 、DMA 溶液标准物质 ( 以 As 质量浓度计为 52. 9 μg /g) 、MMA 溶液标准物质( 以 As 质量浓度计为 25. 1 μg /g) 、砷酸根溶液标准物质 ( 以 As 质量浓度计为 17. 5 μg /g) 均购自中国计量科学研究院; ICP-MS 储备调谐 溶 液 ( 10 mg /L，安捷伦公司) ; NH4 H2 PO4，NH3 ·H2 O ( AR) ; HNO3 ( UP 级，苏州晶瑞公司) ; 尿液由医院志愿者提供。

　　1. 2 样品预处理

　　尿液 过 0. 22 μm 的聚醚砜滤膜后，直 接 用 HPLC-ICP-MS 测定; 当 As 的形态含量超出线性范围时，用纯水稀释适当倍数，再过 0. 22 μm 的聚醚砜滤膜后，用 HPLC-ICP-MS 测定。

　　1. 3 测定条件

　　色 谱 条 件: Hamilton PRP-X100 ( 250 mm × 4. 1 mm，10 μm) 阴 离 子 交 换 分 析 柱，Hamilton PRP-X100( 20 mm × 4. 1 mm，10 μm) 阴离子保护柱; 等度洗脱; 流动相为 20 mmol /L NH4 H2 PO4，用氨 水 调 节 至 pH 8. 0; 柱 温 为 室 温; 流 速 为 1 mL /min; 进样量为 50 μL; 通过 PEEK 管直接同 ICP-MS 雾化器相联，采集时间为 650 s。 ICP-MS 条件: 高频发生器输出功率 1. 55 kW，等离 子 体 气( 氩 气) 15. 0 L /min，辅 助 气 ( 氩 气) 0. 8 L /min，载 气 ( 氩 气) 1. 01 L /min，采 样 深 度 8 mm，采用碰撞池模式，碰 撞 气 ( 氦 气 ) 4. 3 mL /min，雾化器 MicroMist，雾化室温度 2℃，蠕动泵转速0. 3 r/s，监测质量数 m /z 75( As) 。

　　2 结果与讨论

　　2. 1 前处理方法的选择

　　尿液的基体相对简单，同时考虑到正常人的尿液中总砷和各种形态砷含量较低，所以采取直接用 0. 22 μm 的聚醚砜滤膜过滤样品的前处理方法，方法操作简便。若为砷中毒者或是接受砷剂治疗者的尿液，尿液中总砷和某些形态的砷含量会很高，所以采用纯水稀释的适当倍数，再过 0. 22 μm 的聚醚砜滤膜，保证待测各种形态的砷浓度在标准溶液的线性范围内。

　　2. 2 色谱条件的优化

　　2. 2. 1 流动相 在不同的 pH 条件下，AsC，AsB， As( III) ，DMA，MMA 和 As( V) 会呈现不同的电性，可采用阴离子交换柱 Hamilton PRPX-100 分离 6 种不 同 形 态 的 砷。NH4 H2 PO4，HN4H2 PO4，NH4 HCO3缓冲体系是 3 种最常用的流动相，综合考虑流动相分离能力和缓冲盐对 ICP-MS 的影响，选取 20 mmol /L NH4H2PO4作为流动相。

　　2. 2. 2 流动相 pH 流速为1. 0 mL/min 的条件下，研究了 20 mmol /L NH4H2PO4用 NH3·H2O 调节 pH 分别为 6. 4，7. 0，8. 0 和 9. 0 作为流动相对 6 种形态砷分离的影响。随着流动相 pH 的增大，AsC 和 As( III) 的保留时间增长，AsB 保留时间不变，DMA 和 As( V) 保留时间减小，MMA 呈现先减小后增大的趋势。当 pH 6. 4 时，AsB 与 As( III) 没有达到基线分离; 当 pH 7. 0 时，AsB 与 As( III) 分离有所改善，但是 MMA 色谱峰前移而与 DMA 色谱峰开始部分重叠; 当 pH 9. 0 时，As( III) 色谱峰后移与 DMA 色谱峰前移而出现两色谱峰开始部分重叠; 当 pH 8. 0时分离效果最好，所以选取流动相的 pH 8. 0。

　　2. 2. 3 流动相流速 选定 20 mmol /L NH4 H2 PO4 用 NH3·H2O 调至 pH 8. 0 做为流动相，比较了流动相流速为 0. 8，0. 9 ，1. 0 ，1. 1 mL /min 时的分离效果，流速主要对保留时间有影响，对分离度影响不大，流速为 0. 8 mL /min 时 As( V) 的保留时间为 11. 840 min，流速为 1. 1 mL /min 时 As( V) 的保留时间为 8. 569 min; 流速增大，AsC，AsB，As( III) ， DMA，MMA 的色谱峰更拥挤，综合保留时间和整体峰型，选择流动相流速为 1. 0 mL /min。

　　2. 3 线性及范围

　　分别 移 取 适 量 的 AsC，AsB，As( Ⅲ) ，DMA， MMA 和 As( Ⅴ) 的标准溶液至 10 mL 容量瓶中，配制 6 种形态砷的混合标准溶液储备液，临用时用超纯水稀释成 0. 5，1，5，10，25，50，100 μg /L 的系列标准工作溶液。直接分析标准工作溶液，以各形态砷的峰面积( y) 对每个标准溶液对应的浓度 ( x， μg /L，权重为 1 /x) 作回归曲线，得到 6 种形态砷的标准曲线，线性方程、线性范围和相关系数结果见表 1。6 种形态砷中 As( Ⅴ) 的保留时间较长，其色谱峰变得扁平，结合检出限的结果，线性范围为 1 ～ 100 μg /L，其它形态砷的线性范围为 0. 5 ～ 100 μg /L; 6 种形态砷的相关系数均大于 0. 9998，线性相关良好。

　　2. 4 检出限

　　逐级稀释混合标准溶液至 0. 1，0. 2，0. 3，0. 4， 0. 5 μg /L，注入 HPLC-ICP-MS 分析，以色谱峰的 3 倍信噪比确定各形态 砷 的 检 出 限，结 果 见 表 1。 AsC，AsB，As( Ⅲ) ，DMA，MMA 和 As( Ⅴ) 的检出限分别为 0. 4，0. 3，0. 4，0. 4，0. 3 和 0. 5 μg /L。

　　2. 5 准确度和精密度

　　取 9 份尿液，分为 3 组，加入 6 种形态砷的混合标准溶液至浓度分别约为 1，5，10 μg /L，按前处理方法，用 0. 22 μm 的聚醚砜滤膜过滤处理样品，用 HPLC-MS /MS 测定。计算回收率，准确度用回收率表示，结果表明，在低、中、高 3 个加标浓度水平，6 种形态砷的回收率为 87. 0% ～ 109. 3% ，平均回 收 率 为 89. 6% ～ 108. 0% ，满 足 回 收 率 为 80% ～ 120% 的要求。精密度以加标样品实际测得的浓度结果的相对标准偏差( RSD) 表示。结果表明，在低、中、高 3 个加标浓度水平 6 种形态砷的 RSD 为 0. 65% ～ 4. 3% ，均小于 10% ，满足微量测定的精密度要求。

　　2. 6 存储稳定性分析

　　研究了尿液样品保存于 4℃ 的冰箱中各种形态砷的稳定性。一份为正常人加标尿液 ( 加入约 10 μg /L 的 6 种形态砷混合标准溶液) ，另一份为总砷含量约为 1. 22 mg /L[含 As( Ⅲ) ，DMA，MMA 和 As( Ⅴ) ]的实际尿液，样品保存于 4℃ 的冰箱中，分别在 0，7，14 d 取出，测试各种形态砷的含量。结果显示，加标尿液样品中 AsC 含量随存储时间增加而稍微减少，其它 5 种形态砷的含量变化不大; 实际尿液中的 As( Ⅲ) 和 As( Ⅴ) 含量随存储时间增加而减少，DMA 和 MMA 含量随存储时间增加而变大。不同尿液中 6 种形态砷的稳定性不 同，这可能是由于尿液本身成分差别引起，建议收集到样品后尽快分析或是寻找合适的保存条件。

　　2. 7 实际样品测定

　　应用建立的方法测定了 3 个正常人尿液( 1 ～ 3) 和 4 个接受砷剂治疗的白血病患者的尿液( 4 ～ 7) 中的 6 种形态砷，结果见表 2。7 个尿液样品中均没有检出 AsC，同时正常人尿液中，也没有检出 As( Ⅲ) 和 As( Ⅴ) 。在接受砷剂治疗的白血病患者的尿液中，主要以有机砷( DMA 和 MMA) 存在，两种含量大于 4 种形态砷总和的 80% 。

　　参考文献

　　[1] Chen B W，Naramandura H，Lv M L，Le X C. Prog. Chem. ，2009，21( 2) : 474 陈保卫，那仁满都拉，吕美玲，X Chris Le. 化学进展，2009，21( 2) : 474

　　[2] Chen S Z，Du Z X，Liu L P，Jiang H. Chenese J. Anal. Chem. ，2014，42( 3) : 349 陈绍占，杜振霞，刘丽萍，姜 泓. 分析化学，2014，42( 3) : 349

　　[3] Chen S Z，Liu L P，Du H J，Jin P F，Zhou T H. J. Chin. Mass Spectrom. Soc. ，2017，38( 2) : 177 陈绍占，刘丽萍，杜宏举，金鹏飞，周天慧. 质谱学报，2017，38( 2) : 177

　　[4] MaM，Le X C. Clin. Chem. ，1998，44( 3) : 539.

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